Janus激酶2在肿瘤化疗耐药中的作用及在伊马替尼耐药胃肠间质瘤中的潜在应用价值▲

黄梓祥 李泽伦 王晓通 钟晓刚

(广西壮族自治区人民医院胃肠外科，南宁市 530021，电子邮箱：981888025@qq.com)

【提要】 Janus激酶2(JAK2)/信号转导子和转录激活子3(STAT3)是近年来受到学者们广泛关注的细胞内信号通路之一，其能快速将受体收到的膜外刺激信号转导至细胞核内，进而调控下游基因的表达，参与多种细胞功能和行为。随着分子生物学研究深入，STAT3在多种癌症中的异常激活被人们所认识，作为STAT3主要上游激活分子，JAK2在肿瘤中的作用也逐渐受到重视。已有研究表明，JAK2/STAT3通路还参与了多种肿瘤化疗耐药的相关过程，这为解决肿瘤对靶向药物耐药的问题提供了新的思路。随着伊马替尼的临床应用，胃肠间质瘤(GIST)的治疗效果取得了很大改善，但仍有半数以上GIST患者因耐药而出现治疗失败。针对伊马替尼耐药GIST，各国研究者们仍在不断努力寻找解决方案，而目前对JAK2是否参与伊马替尼耐药所知甚少。故本文就JAK2在恶性肿瘤化疗耐药性中的作用及其在伊马替尼耐药GIST中的潜在价值研究进展进行综述。

Janus激酶(Janus kinase，JAK)2是JAK家族中的一员，除JAK3仅存在于骨髓和淋巴系统外，其余JAK家族成员则广泛存在于各种组织和细胞中。研究表明，敲除JAK2的等位基因能导致胚胎致死性的造血功能缺失[1]。JAK/信号转导子和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)是一条转导多种细胞功能的信号通路，目前在哺乳动物体内发现的STAT家族成员有7个，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、STAT5a和STAT5b[2]。在细胞因子(生长因子、炎症因子)的诱导下，上游共有激酶JAK与细胞质中特异性受体产生的优势位点融合，受体与JAK发生聚合反应，引起JAK激酶C端的酪氨酸残基磷酸化而发生活化；活化的JAK蛋白在细胞质中募集信号分子STAT，并识别STAT家族蛋白的SH2功能结构域，在SH2结构域的帮助下，两个STAT蛋白相互靠近、发生磷酸化并进入细胞核内，在细胞核内与相关基因的启动子结合后，直接激活靶基因，调节靶基因的转录和表达，产生相应的生物学效应[3]。生理情况下STAT酪氨酸磷酸化是暂时的，但在许多癌细胞及肿瘤衍生细胞中，其磷酸化处于持续激活的失控状态[4]。许多细胞因子如干扰素家族、γ-C家族和单链家族可激活JAK/STAT信号通路，该通路已被认为是与细胞因子转导乃至肿瘤发生有关的重要信号通路[5]。

1 JAK2在肿瘤耐药性中的作用

目前已有大量研究表明，STAT3的激活在肺癌[6]、乳腺癌[7]、鼻咽癌[8]、结直肠癌[9]等许多实体瘤中很常见，是许多典型的癌基因诱导细胞转化的必经过程[10]。而作为STAT3的主要上游激活分子，JAK2不仅参与了肿瘤的发生和发展，还与肿瘤的侵袭和耐药性有关，有学者发现JAK2的表达下调致使下游分子STAT3表达下调，对肿瘤细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用[6]。

1.1 非小细胞肺癌 肺癌是我国最常见的癌症死亡原因，国内外肺癌的发病率和死亡率均呈快速增长。超过四分之一的非小细胞肺癌患者存在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变，采用抑制剂(如厄洛替尼)可有效抑制EGFR激活并阻断下游信号通路，但随着治疗时间增加，多数患者出现耐药导致治疗失败[11]。研究表明，STAT介导的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)活化导致肺癌细胞对厄洛替尼耐药。Zhang等[12]发现JAK2抑制剂TG101348可显著增强厄洛替尼对EGFR基因突变型非小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用，其作用机制在于TG101348明显降低了磷酸化EGFR、磷酸化STAT3和Survivin的表达。以往的研究表明，EGFR能够上调Survivin的表达，而Survivin已被证明与非小细胞肺癌厄洛替尼耐药有关[13]，Survivin是磷酸化STAT3和EGFR的下游激活物之一，所以JAK2抑制剂通过抑制STAT3的激活，诱导细胞凋亡，增强厄洛替尼对EGFR突变型非小细胞肺癌细胞的抗肿瘤作用，逆转了肿瘤对厄洛替尼耐药性。Harada等[14]通过培育非小细胞肺癌耐药细胞株pc-9/er3，并用JAK2抑制剂联合厄洛替尼处理，发现耐药细胞株恢复了对厄洛替尼的敏感性。由此可见，JAK2/STAT3信号通路的激活是非小细胞肿癌细胞对厄洛替尼获得性耐药的部分原因，而厄洛替尼与JAK2抑制剂联合治疗可以克服这一现象。

1.2 慢性粒细胞白血病 慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种由于t(9；22)费城染色体畸变引起的克隆性疾病。由Bcr-Abl融合基因产生的特定mRNA编码异常的酪氨酸激酶活性蛋白，激活了下游多种转录因子和基因启动子，从而在肿瘤的转化和增殖中发挥关键性作用。伊马替尼是治疗CML的一线药物，但在治疗过程中同样不可避免出现伊马替尼耐药的问题，这可能与静止的CML干细胞有关[15]。Okabe等[16]发现，单用伊马替尼可明显抑制Bcr-Abl阳性的白血病细胞株K562增殖，但在人骨髓基质细胞系HS-5存在的条件下，只能达到部分抑制的作用，而在含HS-5细胞的条件培养基中伊马替尼联合JAK2抑制剂TG101348则可抑制K562细胞的增殖，这是因为HS-5细胞可分泌多种细胞因子，从而保护CML细胞不受伊马替尼侵袭，JAK2则是这些细胞因子通路中的关键。有学者采用干扰RNA技术制备JAK2低表达的CML细胞，发现与空白对照组比较，JAK2低表达的CML细胞的Bcr-Abl磷酸化水平没有降低，而采用伊马替尼处理后Bcr-Abl的下游分子Crk-L和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化减少，这提示JAK2参与了Bcr-Abl的下游信号转导[16]。由此可知，在存在HS-5细胞的环境中伊马替尼单药治疗无法消除静止CML细胞，而JAK2抑制剂联合伊马替尼共同阻断细胞信号通路可能是消除残余CML细胞的一种有效的治疗策略。

1.3 卵巢癌 卵巢癌是女性生殖系统的常见癌症，复发率高，复发后的癌细胞可能出现对紫杉醇耐药，导致化疗失败。在卵巢癌耐药机制中，上皮间充质转换具有关键作用：在肿瘤炎症性微环境中，间充质细胞的主要成分是肿瘤相关成纤维细胞，而后者可通过自分泌或旁分泌的方式分泌多种炎性细胞因子，参与卵巢癌上皮间充质转换和化疗的耐药。Wang等[17]发现，肿瘤相关成纤维细胞产生的白细胞介素6在细胞膜与相关受体结合，激活JAK2/STAT3的下游通路，从而调节上皮间充质转换相关基因和其他基因的表达。张晶晶[18]检测卵巢癌细胞株OC3及紫杉醇耐药细胞株OC3/TAX300中JAK2 mRNA和蛋白的表达水平，发现耐药细胞株OC3/TAX300的JAK2 mRNA表达水平明显高于敏感细胞株；采用含JAK2拮抗剂AG490的溶液对耐药细胞株OC3/TAX30进行培养后发现，细胞中JAK2及STAT3的mRNA和蛋白表达水平随AG490浓度的升高而下降，且耐药细胞株OC3/TAX30对紫杉醇的敏感性增加，细胞周期G2/M比例明显升高。由此得知，JAK2信号转导通路与卵巢癌细胞的生长、发展及耐药性密切相关，AG490可有效抑制JAK2及STAT3 mRNA和蛋白在卵巢癌耐药细胞中的表达，并且增强耐药细胞对紫杉醇的药物敏感性。进一步研究JAK2在卵巢癌中的作用，有助于我们深入了解该病的发生和发展机制，也可为治疗该病提供更好的思路。

1.4 胰腺癌 胰腺癌是一种预后较差的侵袭性恶性肿瘤，具有生存期短、转移早、死亡率高、化疗耐药等特点，临床治疗一般以外科手术为主，但只有少数患者能够耐受手术，而对于不能进行手术的患者则采取顺铂、吉西他滨等化疗或局部放射治疗[19-21]。近年来，胰腺癌基因层面的研究取得一定进展。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一种具有干扰组蛋白去乙酰化酶功能的抑制剂，通过介导组蛋白和非组蛋白的有丝分裂缺陷发挥抗癌作用，是对胰腺癌、肺癌等多种癌症有效的抗癌药物[19，22]。但有研究表明，胰腺癌细胞对组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A有耐药性[23]。Zhang等[24]发现，胰腺癌患者体内JAK2/STAT3信号上游分子白细胞介素6水平增高，且与淋巴结转移、肿瘤分化程度和血管浸润呈正相关；与非耐药细胞株PANC-1相比，曲古霉素A耐药细胞株中的STAT3磷酸化水平明显升高，且其下游靶基因(如c-Myc、c-Src及CCND1)的表达明显升高；高剂量(≥30 μmol/L)的AG490对JAK2/STAT3下游靶基因的表达有明显的抑制作用，并降低曲古霉素A介导的胰腺癌细胞耐药性。这提示了曲古霉素A可能激活白细胞介素6/JAK2/STAT3信号通路，导致STAT3过表达，从而产生耐药。值得注意的是，AG490还能抑制非耐药胰腺癌细胞中的c-Src mRNA的表达[24]，这提示AG490不仅可以逆转曲古霉素A介导的耐药，还可能对胰腺癌有潜在的治疗作用。

2 胃肠间质瘤概述

早在1983年，胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)的概念就已被提出，它是一种罕见的肿瘤，但却是最常见的胃肠道间充质肿瘤，临床症状出现晚且无特异性，发病范围广泛，可发生于胃肠道和腹腔任何部位，多见于胃(占60%，中老年人群中胃小间质瘤常见)，其次是小肠(占30%)，常被误诊而导致治疗延误[25]。

大约60%的局限性GIST患者可经手术治愈，为降低复发率，术中应做到肉眼及显微镜下不破坏肿瘤包膜完整切除肿瘤。术前可根据情况采用伊马替尼新辅助治疗以缩小肿瘤体积，避免过大的损伤范围。但即便是手术R0切除的患者，仍有85%的患者术后出现复发、转移，5年累积总生存率仅50%～65%，5年无复发生存率低至20%～40%[26-28]。近年来的研究显示，GIST患者普遍存在KIT基因(占75%～80%)或血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)α(占5%～10%)突变。这些受体的激活诱导了与GIST发病有关的多种信号通路，包括Ras/Raf/MAPK和磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路[29]，从而使得细胞增殖失控，促进肿瘤的发生和进展，这一发现意义重大，将GIST的治疗提升至靶向药物时代。伊马替尼作为KIT和PDGFR的选择性抑制剂，于2002年2月被美国食品和药物管理局批准用于晚期GIST的治疗[30]。伊马替尼能选择性抑制靶向突变基因的表达，对80%的GIST患者具有确切疗效。但随着伊马替尼的临床应用，大量研究表明，约15%的GIST患者在治疗初期即存在原发性耐药，50%以上的患者随着治疗时间的延长陆续出现继发性耐药，耐药机制可能与基因扩增、二次突变、信号传导通路异常激活或体内药物浓度改变有关[31]。目前，伊马替尼的耐药性问题已成为GIST靶向治疗中最迫切需要解决的问题之一。针对这一问题，目前的应对方案主要有两种，即增加伊马替尼用量或替换二线、三线用药，例如美国食品和药物管理局已批准舒尼替尼二线及瑞格替尼三线的治疗方式。但增加伊马替尼的用量无疑会带来更大的药物副作用，且舒尼替尼及瑞格替尼也会迅速出现耐药反应，两种药物的肿瘤进展中位时间分别为27.3周[32]和20.8周[33]，疗效十分有限。更多更新的分子靶向治疗药物仍在探索中。

3 对伊马替尼耐药的GIST以及JAK2的潜在应用价值

3.1 原发性伊马替尼耐药 尽管目前伊马替尼是治疗转移性或高风险GIST的主要药物，但有少部分亚组患者(15%)在治疗初期即表现出对伊马替尼的原发性耐药。(1)琥珀酸脱氢酶基因突变亚型GIST患者，不存在KIT和PDGFRα基因突变，被归类为WT-GIST，该类型GIST在儿童中常见，在成年人中偶见。Boikos等[34]发现，49例使用伊马替尼治疗的WT-GIST患者中仅有1例对伊马替尼敏感。(2)另一类常见原发性伊马替尼耐药的患者中仅存在PDGFRα基因突变(占5%～7%)，PDGFR基因第18外显子中含D842的密码子替换可能引起伊马替尼耐药，其原因是PDGFR基因外显子D842V的突变导致激酶激活环发生畸变，从而使蛋白质构象强烈倾斜，有利于激活结构；而第18外显子(D846Y、N848K、Y849K和HDSN845-848p)的其他突变均表现为对伊马替尼敏感[35-36]。Cassier 等[37]对58例PDGFRα基因突变的GIST患者进行了研究，发现其中32例患者存在PDGFRα第18外显子D842V突变，17例发生第18外显子其他密码子的突变；剩下的9例则为其他外显子突变，在31例可评估的D842V突变病例中无一例对伊马替尼敏感；D842V突变者中位无进展生存期为2.8个月，其他突变者中位无进展生存期为28.5个月。(3)而在KIT基因突变的GIST患者中，不同位点的突变似乎也存在着药物敏感性的差异。例如，相较于第9外显子突变，第11外显子突变的GIST患者对伊马替尼治疗(400 mg/d)更敏感，但增加伊马替尼药物浓度(800 mg/d)可提高第9外显子突变患者的治疗效果，其原因可能与基因扩增或受体数量有关[38]。据此推测，原发性伊马替尼耐药的原因主要与有无KIT/PDGFRα突变、KIT基因突变类型和PDGFRα-D842V突变有关。

3.2 继发性伊马替尼耐药 有学者对耐药GIST患者的KIT基因分析，发现常见的继发性耐药基因突变位点为第17、13和14外显子，这些位点通常为三磷酸腺苷的结合位点和激活环，以点突变形式居多，认为继发性伊马替尼耐药与KIT/PDGFR基因的二次突变有关[39]。Kang等[40]对继发性伊马替尼耐药患者进行基因型检测，在WT-GIST患者中尚未发现继发性KIT/PDGFR突变，存在原发性第11外显子突变的患者较第9外显子突变患者具有更强继发性突变的倾向。这有可能与GIST患者的用药时间有关，提示继发性突变的概率会随着伊马替尼治疗时间的延长而增加，突变原因可能是长期伊马替尼治疗导致的选择性耐药肿瘤的克隆。

虽然KIT/PDGFR基因的二次突变解释了部分继发性伊马替尼耐药原因，但仍有部分GIST患者未检测到KIT/PDGFR基因的二次突变。有学者认为，继发性耐药与肿瘤激活其他酪氨酸激酶或扩增KIT/PDGFR基因等未知的分子机制有关，在经干细胞因子刺激后，正常活化的c-KIT可激活JAK/STAT通路、PI3K/Akt等下游通路，起到诱导细胞增殖的作用[41]。而GIST中是否有与干细胞因子无关的KIT激活特有的信号转导，目前尚未明确。

3.3 JAK2在伊马替尼耐药GIST中的潜在应用价值 伊马替尼等酪氨酸激酶抑制剂的应用显著改善了GIST患者的预后。关于JAK2耐药性的研究除上文所述的实体瘤外，JAK2耐药性在血液系统恶性肿瘤中的研究也在不断深入[42]。而目前关于JAK2是否参与了伊马替尼耐药GIST的研究仍较少。各个通路在伊马替尼耐药发生机制中可能并不单独存在，当然也不排除伊马替尼药物浓度在血液中的变化引起伊马替尼耐药，比如老年人某些药物可影响伊马替尼在血液中的浓度，体表面积较大者或胃大部分切除术的患者，长期服用伊马替尼后血药浓度下降，使得GIST细胞重新激活，也可能促使了GIST细胞的增殖和耐药。Paner等[43]对11例GIST患者的肿瘤组织进行了免疫组织化学检测后发现，所有GIST细胞质中磷酸化STAT3(Tyr705)表达均较高；随后他们使用AG490抑制JAK2通路，发现经AG490处理后的原代GIST细胞的B细胞淋巴瘤-2基因表达下调，这表明STAT3在GIST中处于异常激活状态，抑制JAK2的表达能够抑制肿瘤生长并诱导凋亡，提示JAK2/STAT3信号通路参与GIST细胞的存活；而在采用伊马替尼治疗后， GIST细胞质中磷酸化STAT3浓度上升，提示可能存在其他激活JAK2/STAT3信号通路的途径。因此，研究JAK2在GIST中的作用可能成为治疗伊马替尼耐药GIST患者的新突破点，为解决伊马替尼耐药性提供新的思路。

4 小 结

因很少在实体肿瘤中检测到JAK2突变，既往认为其主要参与的是血液系统肿瘤等相关疾病。但在实体肿瘤中，JAK2可通过多种通路的异常激活致使细胞增殖失控，从而促进细胞恶性转化，其与人类多种恶性肿瘤的产生、发展、转移及耐药密切相关，研究该蛋白的作用机制有利于有效治疗肿瘤。

虽然目前对JAK2在GIST的发生、发展乃至药物敏感性中的作用机制研究还处于初步阶段，但在其他实体/非实体恶性肿瘤中已发现JAK2通过各种途径的异常激活导致肿瘤对分子靶向药物产生耐药性，而在GIST中，细胞质中JAK2的表达在使用伊马替尼后明显增高，不排除存在不依赖KIT基因激活的JAK2/STAT3信号通路途径，故推测JAK2在GIST伊马替尼耐药中具有潜在研究价值，了解JAK2在GIST中的作用将为GIST患者提供更好的治疗思路及方案。