60Co-γ射线辐照灭菌对固肾生发丸指纹图谱和有效成分含量的影响

朱芹，黄湘杰

1.湘潭市食品药品检验所，湖南 湘潭 411000；2.湘乡市人民医院 药剂科，湖南 湘乡 411400

固肾生发丸的功效是固肾养血、益气祛风，临床用于治疗斑秃、全秃、普秃及肝肾之症状性脱发，是由何首乌、黑芝麻、女贞子、熟地黄、枸杞子、羌活、川芎、木瓜、当归、桑椹、丹参、党参12 味中药加工制成的中药复方制剂[1]。方中重要药味何首乌、女贞子、川芎、木瓜、当归均是直接粉碎成细粉入药，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版明确规定，须对直接入药的生药粉进行灭菌。目前，中药常用灭菌方法有湿热灭菌、环氧乙烷灭菌及辐照灭菌，而辐照灭菌作为一种冷灭菌技术，具有杀菌效果高效、彻底、经济等优势[2-3]。我国自20 世纪80 年代开展60Co-γ射线辐照对中药灭菌工艺和质量评价的研究[4]。1997 年，原卫生部颁发第38 号文件《允许辐照的药材品种名录》[5]，但何首乌、女贞子、川芎、木瓜、当归均未被列入其中，且无文献报道针对60Co-γ射线辐照对固肾生发丸中药原粉影响的研究。因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定何首乌、女贞子、川芎、木瓜、当归中有效成分的含量，结合指纹图谱的方法，分析10批辐照前后共30份固肾生发丸样品指纹图谱和特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素6 个化学成分含量，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012A版和SPSS 19.0软件中配对样本t-检验对结果进行评议，为固肾生发丸采用60Co辐照灭菌提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪，包括G1311A 型四元梯度泵、G1329A 型自动进样器、G1314B 型二极管阵列检测器（DAD）、G1316A 型柱温箱Agilent-Chemistation数据处理系统（安捷伦科技有限公司）；ML204T 型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；S300 型超声波清洗机（40 kHz，500 W，德国Elma 公司）；LM61-HG-S30 型优普系列超纯水机（南京威美特科学仪器有限公司）；辐照源为60Co-γ射线辐照设备（北京易达测量技术有限公司）。

1.2 试药

对照品特女贞苷（批号：111926-201906，纯度：95.0%）、女贞苷（批号：111918-201703，纯度：94.4%）、阿魏酸（批号：110773-201915，纯度：99.4%）、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖 苷（批号：110844-201915，纯度：90.7%）、齐墩果酸（批号：110709-201908，纯度：91.7%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度：96.4%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国默克公司）；磷酸为色谱纯（西陇科学股份有限公司）。

10 批市售固肾生发丸，吉林省俊宏药业有限公司生产，规格：0.25 g/丸，批号分别为20190117（Y1）、20190206（Y2）、20190318（Y3）、20190420（Y4）、20190511（Y5）、20190623（Y6）、20190909（Y7）、20191015（Y8）、20191112（Y9）、20191219（Y10）。

2 方法与结果

2.1 辐照方法与微生物限度检查

取固肾生发丸供试品10 批，平置于60Co 专用辐照室，分别设置3、6、9 kGy 3 个不同辐照剂量及48 h辐照时间。

随机取1 批辐照前后固肾生发丸，制成1∶10、1∶100、1∶1000 的待测液，按照《中国药典》2020 年版（四部）通则1105 规定考察辐照前后样品中微生物的变化情况，结果见表1。从表1 可以看出，随着辐照剂量增大，固肾生发丸的含菌量明显减少。

表1 固肾生发丸辐照前后含菌量测定结果

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A 为乙腈，流动相B 为0.8% 磷酸溶液[6-8]，梯度洗脱（0～20 min，25%～45%A；20～55 min，45%～48%A；55～60 min，48%～65%A；60～70 min，65%～55%A；70～80 min，55%～25%A）；检测波长：254 nm（0～20 min，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）、220 nm（20～55 min，特女贞苷、阿魏酸、女贞苷）、320 nm（55～60 min，大黄素）、206 nm（60～80 min，齐墩果酸）；流速为0.9 mL·min-1；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。在上述色谱条件下，6 个成分色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于5580，系统适用性良好。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 取特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素对照品各适量，加甲醇制成含特女贞苷212.42 μg·mL-1、女贞苷45.92 μg·mL-1、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷190.86 μg·mL-1、阿魏酸115.18 μg·mL-1、齐墩果酸90.69 μg·mL-1和大黄素96.77 μg·mL-1的溶液，混匀，滤过，即得混合对照品储备液。冰箱冷藏保存。

2.3.2 供试品溶液的制备 取固肾生发丸（批号：20190623）及经辐照处理的样品内容物各适量，剪碎，混匀，取约2.0 g，精密称定，置100 mL 棕色量瓶中，加入55%甲醇约85 mL，称定质量，超声处理（450 W，40 kHz，水温：20 ℃）处理45 min，放冷至室温，再称定质量，用55%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液经0.45 μm 的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4 固肾生发丸HPLC指纹图谱的研究

2.4.1 精密度试验 取固肾生发丸（批号：20190623），按2.3.2 项下方法制备成同一供试品溶液，照2.2项下色谱条件连续进样6针。以第一针指纹图谱为对照，计算6 份图谱相似度，结果各指纹图谱相似度结果均大于0.99，符合指纹图谱相似度技术要求（≥0.95），表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取固肾生发丸（批号：20190623），按2.2 项下色谱条件，分别在0、4、8、12、16、24 h 进样。计算相似度（以0 h 进样的色谱图为参照图谱），结果6次进样指纹图谱间相似度均大于0.96，符合指纹图谱相似度技术要求（≥0.95），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批固肾生发丸（批号：20190623）6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，照2.1项下色谱条件进样。计算相似度（以第一次进样的色谱图为参照图谱），结果6 次采集的指纹图谱间相似度均大于0.96，表明方法重复性良好。

2.4.4 固肾生发丸指纹图谱的建立及部分共有峰指认 取10 批固肾生发丸及经3、6、9 kGy 剂量辐照灭菌后的固肾生发丸样品适量，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，照2.2 项下色谱条件测定。分别将辐照前后供试品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012A 版软件，设置时间窗为0.5 min，采用中位矢量法多点校正[9-10]，分别生成0、3、6、9 kGy 辐照处理后固肾生发丸的对照指纹图谱，计算各批不同辐照剂量与对照指纹图谱的相似度。从生成的指纹图谱可以看出，经0、3、6、9 kGy剂量60Co-γ射线辐射处理后的固肾生发丸指纹图谱中，辐照前后色谱峰位置及共有峰数目基本一致，共检测到23 个共有峰，通过与2.3.1 项下混合对照品比对，可确认4 号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、7 号峰为阿魏酸、11 号峰为特女贞苷、13 号峰为女贞苷、18 号峰为大黄素及21 号峰为齐墩果酸。色谱图见图1，计算结果见表2。

表2 10批固肾生发丸相似度计算结果

图1 固肾生发丸HPLC指纹图谱和混合对照品色谱图

2.5 固肾生发丸中6种成分定量分析

2.5.1 线性关系的考察 分别精密量取2.3.1 项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液按2.2 项下色谱条件测定。以各组分质量浓度为横坐标（X），色谱峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果表明：特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素在实验浓度范围内成良好的线性关系。取混合对照品溶液，用甲醇倍比稀释，分别取峰面积信噪比（S/N）为10 时相应对照品质量浓度为定量限（LOQ）。结果见表3。

表3 固肾生发丸中6个成分线性关系考察结果和定量限

2.5.2 仪器精密度试验 取2.2.1 项下的混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件，连续进样6针，记录色谱图。结果特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素峰面积的RSD 分别为0.49%、0.37%、0.66%、0.55%、0.71%和0.88%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一批（批号：20190623）固肾生发丸供试品溶液（0 kGy），按2.2 项下条件，分别于0、5、10、15、20、24 h 进样，记录色谱图。结果特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素峰面积的RSD分别为0.75%、0.65%、0.79%、0.71%、0.84%和0.93%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 耐用性试验 采用3 根规格均为（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同品牌号的C18色谱柱（Agilent Prep、Shimadzu、Durashell）进行分析，6 个成分相互之间及与其他各色谱峰之间均能达良好分离。

2.5.5 重复性试验 称取同一批（批号：20190623）未经辐照固肾生发丸6份，照2.3.2项下方法处理，按2.2 项下条件测定，记录色谱图。结果特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素6种成分质量分数分别为2.181 3、0.420 8、1.657 4、1.812 2、0.611 6、0.646 5 mg·g-1，RSD 分别为0.97%、0.77%、1.12%、1.01%、0.91% 和0.88%，表明本方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取未经辐照灭菌且已知含量的固肾生发丸供试品（批号：20190623）6 份，每份约1.0 g，混匀，精密称定，分别精密加入特女贞苷0.473 6 mg·mL-1、女贞苷0.100 4 mg·mL-1、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.365 9 mg·mL-1、阿魏酸0.393 3 mg·mL-1、齐墩果酸0.133 5 mg·mL-1、大黄素0.139 3 mg·mL-1混合对照品溶液5.0 mL，按2.3.2项下方法制备溶液，按2.2 项下的色谱条件测定，记录色谱图，计算各组分加样回收率，结果见表4。结果特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素的回收率为97.96%～101.29%，RSD 分别为0.94%、0.71%、1.05%、0.45%、0.81%和0.65%。

表4 固肾生发丸5个成分的加样回收率试验

2.5.7 样品测定 分别取10 批未经辐照处理的固肾生发丸供试品及经3、6、9 kGy 剂量辐照处理后的固肾生发丸供试品，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，照2.2 项下色谱条件分析，测定样品中特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素含量，利用SPSS 22.0 软件对灭菌前后含量进行配对t检验，考察不同剂量60Co-γ射线辐射灭菌对固肾生发丸中6个化学成分的影响，结果见表5。

表5 固肾生发丸6个成分含量测定结果 mg·g-1

续表5

采用SPSS 22.0 软件对表5 中6 个化学成分的含量进行统计学分析，对6 个化学成分经3、6、9 kGy辐照灭菌后与未辐照灭菌样品的含量采用配对样本t检验分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。结果显示，辐照剂量为6 kGy 及以下时特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素含量变化差异无统计学意义；当剂量达到9 kGy 时，特女贞苷和女贞苷含量变化差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 指标性成分的选定

固肾生发丸中何首乌是常用的补益中药，主要含有二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类等成分，《中国药典》2020 年版中分别收录何首乌与制何首乌，其均包含二苯乙烯苷及蒽醌类的含量测定项，其代表成分2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素是何首乌发挥功效的特征物质基础，具有补益精血、固肾乌须之功效[11-12]；具有明目乌发、滋补肝肾之功效的女贞子，其代表成分为环烯醚萜苷类特女贞苷及女贞苷，药理研究表明，女贞苷具有抗氧化、增强免疫等作用[13]；阿魏酸既是《中国药典》2020 年版中当归质量控制的指标成分，也是川芎质量控制的指标成分，主要药理作用为行血化瘀、改善人体血液循环系统[14]；2003 年就被列入《药食同源目录大全》的木瓜，三萜类成分齐墩果酸是其主要的活性成分，具有保肝、护肾、调血脂的药理作用[15]。中药指纹图谱可以对多指标、多组分的质量进行整体研究，能全面反映中药中所含的复杂成分及相互关联，为中药质量控制的全面性、深入性提供了有力的保障[16]。故本研究采用HPLC 建立了固肾生发丸的指纹图谱，并对特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素进行含量测定。

3.2 辐照剂量的选择

《中药辐照灭菌技术指导原则》指出，中药辐照剂量原则上不得超过10 kGy，综合以上标准及优先从小剂量考察的原则，选定3、6、9 kGy 3 个剂量。表1结果显示，辐照剂量为3 kGy 时即可达到中药制剂微生物标准。结合表5 含量测定结果，故最佳辐照剂量＜6 kGy。

3.3 60Co-γ射线辐照灭菌结果分析

60Co-γ射线辐照灭菌是利用60Co 产生的γ射线杀灭微生物的过程。本研究以未辐照固肾生发丸的指纹图谱作为参照，不同辐照剂量下所得到的指纹图谱与对照指纹图谱采用相似度评价系统进行比较，结果表明，在＜6 kGy 的辐照剂量下，相似度均大于0.96，说明固肾生发丸的化学稳定性较好；从含量和共有峰数量方面可以看出，辐照灭菌对固肾生发丸无影响。由表5 含量测定结果可知，特女贞苷和女贞苷2种成分在辐照剂量为9 kGy 时平均质量分数分别降低54.09%和47.54%，含量变化差异有统计学意义（P＜0.05）。特女贞苷中的环烯醚萜部分通过其裂环上的酯键与红景天苷相连，而女贞苷则与酪醇或羟基酪醇等苯乙醇类化合物相连，均属于裂环环烯醚萜苷类多酚化合物[17]，性质不稳定、酯键断裂，这可能是导致特女贞苷和女贞苷在辐照剂量9 kGy时含量降低主要原因。

本研究建立了不同剂量60Co-γ辐照灭菌前后的固肾生发丸HPLC指纹图谱，同时，建立了HPLC测定固肾生发丸中特女贞苷、女贞苷、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齐墩果酸、大黄素6 个成分含量的方法，并通过相关软件比较了辐照灭菌前后6 个成分含量的变化。研究结果显示，经60Co-γ辐照灭菌剂量不超过6 kGy，适用于固肾生发丸的质量控制。