不同产地肉苁蓉饮片HPLC指纹图谱与化学模式识别△

毕天琛，杨国宁，王素香，赵丹彤，3，刘延娟

1.菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000；2.青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266000；3.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355

肉苁蓉为多年生草本寄生植物，为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉苁蓉C.tubulosa（Schenk）Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎[1]。肉苁蓉始载于《神农本草经》，为我国传统沙生名贵补益类中药，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能[1-3]。其主要产地包括内蒙古、宁夏、新疆、甘肃和青海等地[4]。肉苁蓉的化学成分主要有苯苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、多糖及单萜苷类、生物碱等[4]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版肉苁蓉品种含量测定项下仅规定了松果菊苷和毛蕊花糖苷总量，并未对其他成分做出相关规定。目前，已有关于肉苁蓉中管花苷A、肉苁蓉苷A、肉苁蓉苷C、异毛蕊花糖苷等成分含量测定和指纹图谱研究的报道[5-12]，但只是对其中几种指标性成分进行研究，不能全面反映肉苁蓉饮片整体质量的优劣。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱结合化学模式识别法对肉苁蓉饮片质量进行综合分析评价，为其质量标准研究提供切实可行的参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪、二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）；XS105 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；FRQ-1010T 型超声波清洗器（杭州法兰特超声波科技有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

对照品松果菊苷、毛蕊花糖苷（中国食品药品检定研究院，批号分别为111670-201706、111530-201713，纯度分别为89.7%、92.5%）；对照品京尼平苷酸（批号：18112101，纯度≥98%）、肉苁蓉苷A（批号：17062001，纯度≥95%）、管花苷A（批号：18032105，纯度≥98%）、异毛蕊花糖苷（批号：18102404，纯度≥98%）、2'-乙酰毛蕊花糖苷（批号19011705，纯度≥96%）、管花苷B（批号：17052704，纯度≥97%）均购自成都普菲得生物技术有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；乙酸为优级纯（德国Merck公司）。

10 批肉苁蓉饮片均购自市场，经菏泽市食品药品检验检测研究院马海春副主任中药师鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 的干燥带鳞叶的肉质茎，见表1。

表1 肉苁蓉饮片样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%乙酸（B），梯度洗 脱（0～7 min，10%～19% A；7～25 min，19%～22%A；25～35 min，22%～25%A；35～36 min，25%～10%A；36～40 min，10%A）；检测波长：330 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取各对照品适量，加入50%甲醇溶解制备成含京尼平苷酸0.980 mg·mL-1、松果菊苷1.052 mg·mL-1、肉苁蓉苷A 1.044 mg·mL-1、管花苷A 0.953 mg·mL-1、毛蕊花糖苷0.986 mg·mL-1、异毛蕊花糖苷1.078 mg·mL-1、2'-乙酰毛蕊花糖苷1.181 mg·mL-1、管花苷B 0.986 mg·mL-1的混合对照品储备溶液。精密量取上述储备溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取肉苁蓉样品粉末（过四号筛）1.0 g，精密称定，置于100 mL 棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称量，超声提取40 min，放冷后加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取肉苁蓉饮片（S1）制备的供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积和保留时间。以松果菊苷（4 号峰）为参照峰，分别计算其他16 个色谱峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果16 个色谱峰相对峰面积的RSD为0.13%～0.58%，相对保留时间的RSD为0.24%～1.45%，表明该方法的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取肉苁蓉饮片（S1）制备的供试品溶液，分别室温放置0、2、4、6、12、24 h后，按照2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积和保留时间。以松果菊苷（4 号峰）为参照峰，分别计算其他16 个色谱峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果16 个共有色谱峰相对峰面积的RSD 为0.22%～0.74%，相对保留时间的RSD为0.51%～1.82%，表明供试品溶液在室温下放置24 h 内稳定。

2.4.3 重复性试验 称取同一份肉苁蓉饮片样品（S1）粉末约1.0 g，精密称定6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进行测定。以松果菊苷（4号峰）为参照峰，分别计算其他16个色谱峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果16 个共有色谱峰相对峰面积的RSD 为0.08%～0.26%，相对保留时间的RSD 为0.33%～1.24%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 HPLC 指纹图谱测定 取不同产地10 批肉苁蓉饮片样品，按照2.3 项下方法制备供试品溶液，按照2.1 项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1。

图1 10批肉苁蓉饮片的HPLC叠加指纹图谱

2.5.2 共有模式的建立及共有峰确定 将2.5.1 项下条件下测定的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统”2012 A 版软件，以S1 样品为参考图谱，时间窗宽度设为0.1 s，中位数法生成对照指纹图谱（图2）。以4 号峰作为参照峰S，对不同肉苁蓉饮片的指纹图谱进行考察，共确定17 个共有峰。

图2 10批次肉苁蓉饮片的HPLC对照指纹图谱

通过对照品溶液比对，指认了其中8 个色谱峰，分别为1 号（京尼平苷酸）、4 号（松果菊苷）、8 号（肉苁蓉苷A）、9 号（管花苷A）、10 号（毛蕊花糖苷）、11号（异毛蕊花糖苷）、16号（2'-乙酰毛蕊花糖苷）和17号（管花苷B）。结果见图3。

图3 肉苁蓉8种混合对照品HPLC图

2.5.3 相似度评价 采用“中药指纹图谱相似度评价系统”2012 A 版软件，以样品的HPLC 对照指纹图谱为对照，进行整体相似度评价。结果10 批样品的相似度为0.941～0.999，见表2，说明各批样品之间整体差异性较小。

表2 10批肉苁蓉饮片样品的相似度评价

2.6 聚类分析

以4 号峰为参照，以10 批样品中17 个共有峰的相对峰面积为变量，采用SPSS 22.0 统计学软件进行聚类分析，采用组间联接的聚类方法，以欧氏距离为区间进行聚类分析，生成聚类树状图（图4）。10 批样品大致可分为2 类，S1、S3 聚为一类，其余为一类，S1、S3 中4～7、9、11、12 号峰面积均明显大于其余样品。S1、S3、S5、S9、S10 产地均为新疆，S2、S4、S7、S8 产地均为内蒙古，但均未聚为一类，说明同一产地肉苁蓉饮片质量存在差异。

图4 10批肉苁蓉饮片聚类分析树状图

2.7 主成分分析

采用SPSS 22.0 软件对10 批肉苁蓉饮片样品中17 个共有峰面积进行主成分分析。结果显示，共得到4 个主成分因子，特征值分别为8.148、2.852、2.461 和1.326，方差贡献率分别为47.927%、16.779%、14.474%和7.800%，累积方差贡献率为47.927%、64.705%、79.179%和86.979%（表3），提示主成分因子1～4 可作为评价不同肉苁蓉饮片的评价指标。根据因子载荷矩阵表（表4）和因子载荷图（图5）可以看出，主成分因子1 与11 个共有峰相关性均较强，特别是峰4～7、9、11和12；主成分因子2 与峰16、17 相关性较强；主成分因子3 与峰3、8、13 和14 相关性较强，特别是峰14；主成分因子4 与峰10 相关性较强。根据各主成分载荷向量乘以各主成分特征值的算术平方根计算各批样品的综合得分，结果见表5。其中S1、S3 综合得分较高，S5、S6、S9、S10 相对较低，与聚类分析结果一致。

表3 肉苁蓉中主成分特征值和贡献率

表4 肉苁蓉中初始因子载荷矩阵

图5 肉苁蓉中因子载荷图

表5 10批肉苁蓉饮片主成分得分和综合得分

3 讨论

本研究前期对液相条件进行优化，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液5 种流动相及8 个梯度洗脱条件，结果以乙腈-0.5%乙酸溶液为流动相时，梯度洗脱效果最好。采用二极管阵列检测器进行190～400 nm 全波长扫描，结果显示，在330 nm 波长下色谱峰较多，响应值较高，因此，采用330 nm 作为指纹图谱检测波长。综上，确定了2.1 项下色谱条件作为肉苁蓉饮片指纹图谱液相色谱条件。

10 批肉苁蓉饮片样品指纹图谱共确定17 个共有峰，并指认了其中8 个成分，分别为京尼平苷酸、松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2'-乙酰毛蕊花糖苷和管花苷B。结果显示，不同样品之间相对保留时间相差较小，但相对峰面积有一定差异，说明不同样品之间部分成分含量存在差异。与对照指纹图谱的相似度为0.941～0.999，说明不同样品质量稳定、相似度较好。通过聚类分析和主成分分析发现，10 批样品可分为2 类，S1 和S3 为一类，与其他8 批存在明显差异，同时确定了4 个主成分，筛选出7 个差异性成分，分别是峰4～7、9、11 和12。目前，《中国药典》2020 年版选用松果菊苷和毛蕊花糖苷作为肉苁蓉饮片的含量测定指标成分，本研究发现7 个成分在各产地肉苁蓉饮片指纹图谱中起决定作用，包括松果菊苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷，但不包括毛蕊花糖苷，为评价肉苁蓉饮片综合质量提供了新方法。

综上所述，本研究建立的肉苁蓉饮片HPLC 指纹图谱及聚类分析和主成分分析方法可以反映出不同产地的肉苁蓉饮片的质量水平，可用于肉苁蓉饮片质量控制及评价，为肉苁蓉饮片标准研究提供参考。