Box-Behnken设计响应面法优化土元凝胶贴膏基质研究△

邓玉莹，邵炳豪，位雪，王慧慧，王春梅

北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488

土鳖虫又名土元，为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensisWalker 或冀地鳖Steleophaga plancyi（Boleny）的雌虫干燥体，有小毒，可用于跌打损伤、筋伤骨折、血瘀经闭等[1]。现代研究表明，土元具有溶解血栓、拮抗凝血、促进骨折愈合等多种药理活性[2-5]。本课题组前期研究也发现，土元对成骨细胞模型MC3T3-E1 细胞具有显著的促增殖作用，且可促进骨折大鼠的恢复[6]。本实验使用土元提取物，优化了土元凝胶贴膏基质，为其开发成为一种治疗外伤骨折等疾病的外用制剂奠定了基础。凝胶贴膏指原料药物与适宜的亲水性基质混匀后涂布于背衬材料上，制成的贴膏剂，具有使用方便、载药量大、药物透皮吸收效率高等显著优点，且具有局部给药、降低药峰浓度、可随时停药等特点，更适合毒性药物的使用[7]。凝胶贴膏基质主要由骨架材料、交联剂、交联调节剂、保湿剂、填充剂等组成，骨架材料可交联形成凝胶网络结构，提供一定的胶强度和黏性；交联调节剂可避免交联过快导致的涂布困难；保湿剂在保留水分的同时，可增加凝胶贴膏柔韧度；填充剂既可吸附药物，也可提供基质强度。本实验以初黏力、剥离强度、持黏力为指标，单因素试验结合Box-Behnken 设计响应面法优化凝胶贴膏基质，以确定最佳的土元贴膏空白基质处方，而后通过正交试验法确定含药凝胶贴膏处方，本研究所得的凝胶贴膏基质更适用于黏度较低的中药提取物。

1 材料

PB303-S 型电子天平（北京Sartorius 仪器有限公司）；CNS-11888 型胶带初黏力测定仪（济南赛成电子科技有限公司）；CZY-25 型持黏性测试仪、BLD-200N 型电子剥离试验机（济南兰光机电技术有限公司）。

聚丙烯酸钠（NP-700，北京希比希贸易有限公司）；甘羟铝（北京希比希贸易有限公司；分析纯）；氢氧化铝、柠檬酸、酒石酸、甘油（北京化工厂，批号分别为20141010、20140814、20170606、20200630）；高岭土（上海源叶生物科技有限公司，批号：Z25J10Y91491）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；无纺布；压花膜。

2 方法

2.1 空白凝胶贴膏的制备方法

A 相：称取处方量的酒石酸，加纯净水搅拌至完全溶解。B 相：称取处方量甘羟铝、NP-700、高岭土至蒸发皿中混合，加入甘油搅拌均匀。将A 相边搅拌边加入B 相中，以约60 r·min-1手动搅拌均匀，后置于无纺布上加盖压花膜进行涂布，室温放置成型。

2.2 指标的测定和评价方案

2.2.1 测定方法

2.2.1.1 初黏力 按照《中华人民共和国药典》2020 年版黏附力测定第一法规定采用斜坡滚球测定。

2.2.1.2 剥离强度 取供试凝胶贴膏贴于洁净的不锈钢板上，用2 kg 的压辊以自身质量来回挤压3 次，放置10 min 后，置于电子剥离试验机上进行剥离实验，测力计以300 mm·min-1的速度将其从不锈钢板上拉离并做180°折返，记录测力仪显示的读数。平行测试3次，取平均值。

2.2.1.3 持黏力 将供试凝胶贴膏（6 cm×3 cm）粘贴于2 块不锈钢板中央相接处，用2 kg 的压辊以自身质量来回挤压3 次，悬挂于持黏性测试仪上，垂直放置，悬挂200 g砝码，计时，记录钢板落下的时间（s），平行测试2次，取平均值。

2.2.2 评价方案

为了能全面评价贴膏的性能，本实验采用综合评价方案。将2.1项下的每个指标均标准化为0～1的“归一值（OD值）[8]”。对取值越大越好的因素（初黏力、持黏力及剥离强度＜0.333 kN·m-1者），按公式（1）计算归一值（dmax），对剥离强度＞0.333 kN·m-1者，按公式（2）计算归一值（dmin）。在单因素试验与载药量考察中，综合评分计算方法为将得到的“归一值”求平均值，按公式（3）计算，在Box-Behnken设计试验中综合评分方法为计算三者几何平均得到总“归一值”，按公式（4）计算。

式中，dmax为取值越大越好的因素归一值；dmin为取值越小越好的因素归一值；Y为本指标测定值；OD为总归一值。

剥离强度越小，揭下凝胶贴膏时痛感越小，但剥离强度同时反映了基质黏度，故本实验对8 篇已发表的凝胶贴膏基质优化实验文献的配方进行了重复[9-16]，检测其初黏力和剥离强度，并确定适宜的剥离强度，结果见表1。

表1 8篇文献中初黏力及剥离强度测定值

由表1 可知，凝胶贴膏初黏力和剥离强度间存在一定的正相关，回归系数R²=0.763 9，说明在评价凝胶贴膏基质时不是剥离强度越小越好，8 篇文献中剥离强度平均值为0.333 kN·m-1，故认为以剥离强度为0.333 kN·m-1时评分最高。

2.3 单因素试验

2.3.1 交联时间考察 交联型凝胶贴膏基质强度的来源是交联剂和骨架材料的交联作用，凝胶贴膏基质强度会随着交联时间增加而改变，故本实验首先考察凝胶贴膏交联时间。按照2.1 项下方法平行制备7 张空白凝胶贴膏，分别放置1～7 d 后，按2.2.1项下方法测试指标，按2.2.2项下方法评价贴膏。

2.3.2 优选交联剂种类 本实验考察氢氧化铝、甘羟铝不同用量对凝胶贴膏基质性状的影响。取酒石酸0.4 g，纯净水20 g，搅拌均匀作为A 相，另取聚丙烯酸钠10 g，分别加入氢氧化铝或甘羟铝0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，混合均匀后加入甘油20 g，搅拌均匀作为B相；制备凝胶贴膏评价。

2.3.3 优选交联调节剂种类 本实验考察酒石酸、柠檬酸不同用量对凝胶贴膏基质性状的影响。分别取酒石酸或柠檬酸0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，纯净水20 g，搅拌均匀作为A相，另取聚丙烯酸钠10 g、加入甘羟铝0.3 g，混合均匀后加入甘油20 g，搅拌均匀作为B相；制备凝胶贴膏评价。

2.3.4 优选保湿剂用量 本实验选择甘油作为保湿剂，取酒石酸0.3 g，纯净水20 g，搅拌均匀作为A相，另取聚丙烯酸钠10 g、加入甘羟铝0.3 g，混合均匀后分别加入甘油18、27、36、45、54 g，搅拌均匀作为B相；制备凝胶贴膏评价。

2.3.5 优选纯净水用量 取酒石酸0.3 g，纯净水12、24、36、48、60 g，搅拌均匀作为A 相，另取聚丙烯酸钠10 g、加入甘羟铝0.3 g，混合均匀后加入甘油36 g，搅拌均匀作为B 相；制备凝胶贴膏评价。

2.3.6 优选填充剂用量 本实验选择高岭土作为填充剂。取酒石酸0.3 g，纯净水24 g，搅拌均匀作为A 相，另取聚丙烯酸钠10 g、甘羟铝0.3 g，分别加入高岭土0、4、8、12、16 g，混合均匀后加入甘油36 g，搅拌均匀作为B相；制备凝胶贴膏评价。

2.4 Box-Behnken响应面设计试验

2.4.1 考察因素与水平 以2.3 项下的单因素试验结论为基础，根据试验结果选取对贴膏影响较大的酒石酸用量（A）、甘羟铝用量（B）、甘油用量（C）和高岭土用量（D），采用Box-Behnken 设计安排试验，考察因素与水平见表2。

表2 土元凝胶贴膏Box-Behnken设计因素水平

2.4.2 数据结果与处理 利用Design-Expert V8.0.6 软件安排试验，按2.1 项下方法制备，2.2.1项下方法测试指标。

2.5 验证实验

对得出的最优成型工艺进行3 批平行试验，并测试初黏力、持黏力、剥离强度、膜残留性指标，并将此数据与Design-Expert V 8.0.6 软件中给出的预测值对比。

2.6 载药量的考察

土元贴膏所载药物为土元提取物的冻干粉，其制备方法如下：土元加8 倍量水，提取2 次，每次40 min，纯化后冻干。药物含量设置4 个水平，按2.4 项下得到的最佳配比，分别加入贴膏总质量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的土元冻干粉，制备凝胶贴膏评价。

为尽可能增大载药量，以载药量（X）、高岭土用量（Y）、甘油用量（Z）和为因素，使用正交设计对含药贴膏进行再次优化，因素水平见表3。

表3 土元凝胶贴膏载药量正交试验因素水平

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 交联时间考察 由图1 可知，凝胶贴膏在交联3 d后综合评分最高，其黏性和胶强度适宜，故确定交联时间为3 d。

图1 土元凝胶贴膏交联时间考察结果

3.1.2 优选交联剂种类 由图2 可知，甘羟铝用量在0.2～0.4 g 时综合评分均高于氢氧化铝，同时发现，随交联剂用量增加，膏体硬度增加，用料超过0.5 g时，膏体交联速度过快，难以涂布，故选择交联剂为甘羟铝，在后续实验中甘羟铝的优化为0.2～0.4 g。

图2 土元凝胶贴膏交联剂种类考察

3.1.3 优选交联调节剂种类 由图3 可知，2 种交联调节剂用量为0.2～0.4 g时综合评分高于0.5～0.6 g，且酒石酸综合评分高于柠檬酸，故确定交联调节剂种类为酒石酸，后续优化用量为0.2～0.4 g。

图3 土元凝胶贴膏交联调节剂种类考察

3.1.4 优选保湿剂用量 由图4 可知，随保湿剂甘油用量增加，综合评分先增大后减小，当甘油用量为27～45 g 时综合评分最优，故选用27～45 g 为后续实验考察范围。

图4 土元凝胶贴膏保湿剂用量考察

3.1.5 优选纯净水用量 由图5 可知，随着水用量的增加，综合评分先增大后减小，当水用量为24 g时，凝胶贴膏性状最优，故确定后续实验用水量为24 g。

图5 土元凝胶贴膏水用量考察

3.1.6 优选填充剂用量 由图6 可知，随填充剂高岭土的增加，综合评分先减小后增加再减小，当高岭土用量为4～12 g 时综合评分最优。同时，实验发现，高岭土用量为16 g 时，膏体过硬，难以涂布，故后续实验选用4～12 g为考察范围。

图6 土元凝胶贴膏填充剂用量考察

3.2 Box-Behnken响应面设计试验

指标测定结果见表4，回归方程的方差分析见表5，预测效应面图见图7。根据实验结果，以OD值对所选的4个因素通过多元回归分析可得到含有曲率的二阶响应表面模型方程，即OD=0.54+0.10A+0.30B-0.082C+0.64D-0.004AB+0.06AC+0.071AD-0.13BC+0.16BD-0.008 25CD-0.16A2-0.068B2-0.084C2+0.022D2（P＜0.000 1，r=0.903 5）；方程中模型皆显著，失拟项皆不显著，表明该模型可以很好地预测凝胶贴膏性状。r＞0.9，残差皆分布在一条直线上，进一步说明模型拟合优度较好，可用来对凝胶贴膏的制备工艺进行初步分析和预测。

表4 土元凝胶贴膏Box-Behnken设计与指标测定结果

根据表5 可知，4 个因素对OD 值影响均显著，即酒石酸、甘羟铝、高岭土和甘油的用量可以显著改变凝胶贴膏基质性状。凝胶贴膏中NP-700 与甘羟铝反应，形成凝胶网络结构，可以提高基质胶强度；酒石酸可以促进铝离子电离，进而调节交联反应速度；高岭土可以增加凝胶贴膏黏弹性，进而改变黏度及药物释放；甘油可以促进皮肤水合作用，且可以改变膏体黏度，不同基质组成间具有一定的交互作用[17-18]。预测响应面图中，等高线越接近椭圆，说明2个因素间相互作用越大。由图7可知，多种因素间存在相互作用。响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，通过对具有代表性的各点进行试验，回归拟合全局范围内因素与结果间的函数关系，并且取得各因素最优水平值[19]，其较为常用的试验设计方法有Box-Behnken 设计和星点设计法，均可以考虑不同因素间的相互作用。本实验在单因素试验的基础上确定各辅料合理使用区间，可使Box-Behnken 设计-响应面法优化效率更高、结果更可信。

图7 土元凝胶贴膏OD值预测响应面图

表5 土元凝胶贴膏Box-Behnken设计结果OD值方差分析

通过Design-Expert V 8.0.6软件分析得出1组最优的成型工艺参数：NP-700 10.00 g、甘羟铝0.40 g、酒石酸0.32 g、甘油36.65 g、高岭土12.00 g、水24.00 g，此时初黏力可粘住直径为18.764 mm 的钢球，持黏力达到600 s，剥离强度为0.321 kN·m-1。

3.3 验证实验

以最优成型工艺进行3批平行验证，结果见表6。验证实验各指标RSD 均小于5%，表明差异无统计学意义，且实测值和预测值相近，认为此工艺稳定可行，可用于后续土元凝胶贴膏的开发与应用。

表6 土元凝胶贴膏验证实验结果

3.4 载药量的考察

以初黏力、持黏力、剥离强度为指标，在空白贴膏的基础上对载药量进行考察，结果见表7。由表7 可知，随着载药量的增加，凝胶贴膏黏性逐渐降低，同时在制备含药凝胶贴膏的过程中发现，冻干粉的加入可以起到类似填充剂的作用。为保证在含药量尽量大的同时贴膏黏性不下降，使用正交设计法，以载药量、高岭土和甘油含量为因素，进行L9（3）4正交试验，优化最佳含药凝胶贴膏处方，结果见表8～9。

表7 土元凝胶贴膏载药量的筛选

表8 土元凝胶贴膏载药量正交试验结果

表9 土元凝胶贴膏正交试验OD值方差分析

方差分析发现，载药量、高岭土用量和甘油用量对OD 值影响皆显著，说明3个因素对凝胶贴膏均有较大影响。从直观分析表可发现，当X 为1、Y 为2、Z 为2 时，凝胶贴膏综合评分最高，其中X 的1、2 水平间差距较小，为尽量增加载药量，选择最优工艺为X2Y2Z2，即载药量10%，高岭土8 g，甘油36 g。使用最佳处方进行3 次平行验证，其初黏力平均可粘住直径为10.319 mm小球，持黏力平均值为255 s，剥离强度平均值为0.292 kN·m-1，明显优于未优化前（9.525 mm、46 s、0.097 kN·m-1），故认为此工艺稳定可行。

土元冻干粉中大部分为蛋白质，另有少量脂肪和氨基酸，其和A 相混合后呈混悬液，加入凝胶贴膏后会显著降低其黏性，但对基质强度影响较小。目前，中药凝胶贴膏的研究多以植物药为原料，其提取物中含大量多糖、鞣质或各种脂溶性化合物，其可降低凝胶贴膏黏性和胶强度。本实验制备得到的凝胶贴膏减少了填充剂的使用，更适用于各种低黏性药物，如各种动物药、粉质类药材提取物或单体化合物，但可能不适用于含大量脂溶性成分的中药提取物。

最终优化的具体处方为NP-700 10.00 g、甘羟铝0.40 g、酒石酸0.32 g、甘油36.00 g、高岭土8.00 g、水24.00 g，载药10%土元冻干粉，制备方法为将NP-700、甘羟铝、甘油、高岭土混匀后作为B 相，酒石酸、土元冻干粉、水混匀后作为A 相，将A 相边搅拌边加入B相中，以约60 r·min-1手动搅动均匀，后置于无纺布上加盖压花膜进行涂布，室温放置3 d即得。

4 结论

本实验制备得到了初黏力高、剥离无痛感、胶体强度大的土元凝胶贴膏，其基质更适用于低黏性药物及其提取物，后续实验证实，其具有良好的促骨折愈合活性，且无皮肤刺激性或毒性，为土元凝胶贴膏的临床应用打下了良好的基础。