APP下载

高效液相色谱法同时测定吴茱萸-桂枝药对水煎液中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸含量*

2021-12-01莹,薛莹,江

中国药业 2021年22期
关键词:桂皮项下吴茱萸

兰 莹,薛 莹,江 阳

(四川省疾病预防控制中心,四川 成都 610041)

吴茱萸-桂枝药对是《金匮要略》中温经汤的核心药对[1]。吴茱萸味苦辛、性温热,有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻功效,常用于治疗呕吐泄泻、厥阴头痛、高血压等[2]。吴茱萸碱、吴茱萸次碱是吴茱萸的主要有效成分[3],二者具有促进肿瘤细胞凋亡、保护心脏血管系统、调节免疫系统等药理活性[4-6],其中吴茱萸碱可通过下调NOD1通路诱导肝癌HepG2和SMMC-7721细胞凋亡[7],吴茱萸次碱能明显防治模型大鼠腹主动脉狭窄所致左室肥厚[8]。桂枝味辛、甘,性温,有散寒解表、温通经脉、平冲降气等功效,常用于治疗风寒感冒、血寒闭经、水肿、心悸等症[9],桂皮醛、桂皮酸是其主要有效成分,二者可降低血压、抑制肿瘤细胞生长、保护受损的心肌等[10-11],且桂皮醛可能通过上调肝脏胰岛素信号通路Akt而发挥降血糖作用,并可抑制食管癌鳞状细胞癌细胞Eca109的增殖,促进其凋亡[12-13],桂皮醛、桂皮酸对缺血性心肌损伤模型大鼠心脏还具有保护作用[14]。因此,检测茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸的含量对于评价吴茱萸-桂枝药对的质量有重要意义。本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法同时检测吴茱萸-桂枝药对水煎液中上述4种成分的含量,为该药对的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity HPLCTM高效液相色谱仪,包括Empower 3.0色谱工作站,四元高压泵系统,在线脱气系统,自动进样器,柱温箱和TUV检测器,数据采集系统(美国Waters公司);XS215型分析天平、XP6型微量天平(美国Mettler Toledo公司);KQ-500D型超声波清洗器(上海沪粤明科学仪器有限公司);KW8672J型离心机(北京京立离心机有限公司)。

1.2 试药

吴茱萸药材(批号为190816)、桂枝药材(批号为186018),均购自郑州张仲景大药房;吴茱萸碱对照品(批号为50890-1806,含量≥99.6%),吴茱萸次碱对照品(批号为280375-181102,含量≥98.9%),桂皮醛对照品(批号为110710-201821,含量≥99.6%),桂皮酸对照品(批号为28573-1914,含量≥98%),均购自中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯,甲醇、磷酸均为分析纯,水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil®Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~8 min时7%A→18%A,8~16 min时18%A→36%A,16~25 min时36%A→60%A,25~37 min时60%A→100%A,37~42 min时100%A→7%A,42~47 min时7%A);流速:1 mL/min;检测波长:215 nm(10~20 min,吴茱萸碱、吴茱萸次碱),290 nm(25~38 min,桂皮醛、桂皮酸);柱温:25℃;进样量:10μL。

2.2 溶液制备

称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸对照品各适量,精密称定,分别置10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得质量浓度分别为2.6420,2.2910,1.9655,1.7088 mg/mL的单一对照品贮备液;各取2.5 mL,置同一25 mL容量瓶中,加甲醇定容,得吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸质量浓度分别为0.26420,0.22910,0.19655,0.17088 mg/mL的混合对照品溶液。按吴茱萸-桂枝药对比例(1∶1,m/m)称取吴茱萸、桂枝各30 g,精密称定,置500 mL圆底烧瓶中,一煎加360 mL水,提取2 h,药液经200目滤布滤过,得一煎水提液。药渣加300 mL水,提取1 h,药液经200目滤布滤过,得二煎水提液。合并两煎水提液,搅拌均匀,静置2 h,得吴茱萸-桂枝药对水煎液630 mL。精密量取25 mL,置离心管中,3000 r/min离心10 min,精密移取20 mL,置蒸发皿中水浴减压蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中,定容,经0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液。按吴茱萸-桂枝药对水煎液处方及工艺,制备缺吴茱萸、桂枝的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:分别取2.2项下3种溶液各适量,按2.1项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中,在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应吸收峰,阴性对照无干扰。详见图1。4种成分峰理论板数均大于10000,分离度均大于2。

图1 高效液相色谱图1.evodiamine 2.rutecarpine 3.cinnamaldehyde 4.cinnamic acid A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察:取2.2项下混合对照品溶液适量,稀释成吴茱萸碱质量浓度为0.0264,0.0528,0.0793,0.5284,0.7926,2.6420 mg/mL,吴茱萸次碱为0.0229,0.0458,0.2291,0.4582,0.6873,2.2910 mg/mL,桂皮醛为0.0196,0.0393,0.0589,0.1966,0.5897,1.9655 mg/mL,桂皮酸为0.0170,0.0342,0.0512,0.1708,0.5126,1.7088 mg/mL的系列混合对照品溶液,各精密量取10 mL,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积。以各成分的质量浓度(X,mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程及线性范围。结果见表1。

表1 线性关系考察结果(n=6)Tab.1 Results of the linear relation test(n=6)

精密度试验:取供试品溶液,按2.1项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积。结果吴茱萸-桂枝药对水煎液中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸峰面积的RSD分别为0.29%,0.06%,0.08%,0.26%(n=6),表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取供试品溶液适量,室温下分别放置0,1,2,4,8,12,24 h时按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸峰面积的RSD分别为1.33%,0.38%,1.66%,1.08%(n=7),表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

重复性试验:取样品适量,各6份,按2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算含量。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸平均含量分别为0.9819,0.5896,0.2135,0.6798 mg/g,RSD分别为0.81%,1.01%,1.22%,2.15%(n=6),表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品适量,共9份,分别加入低、中、高质量浓度的对照品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算回收率,结果见表2。

表2 加样回收试验结果(n=9)Tab.2 Results of the recovery test(n=9)

2.4 样品含量测定

取样品,按2.2项下方法平行制备2份供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算样品含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(mg/g,n=2)Tab.3 Results of content determination of four components in the sample(mg/g,n=2)

3 讨论

3.1 流动相选择

预试验中分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液4个流动相系统进行了考察。结果发现,采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相时,各色谱峰的分离度较好,且基线平稳,因此采用乙腈-0.1%磷酸水溶液统作为流动相。

3.2 色谱柱选择

预试验中分别考察了Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Diamonsil®Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Welch XB C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),结果发现,Diamonsil®Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)效果较好,故以该色谱柱进行试验。

3.3 检测波长选择

对4种成分对照品溶液分别进行紫外-可见全波长(190~400 nm)扫描,发现吴茱萸碱、吴茱萸次碱在215 nm,桂皮醛、桂皮酸在290 nm处有最大吸收,鉴于吴茱萸-桂皮药对中4种成分最大吸收波长不同,为保证各成分在最大吸收波长处检测,提高灵敏度,减少干扰,故本试验中采用了HPLC法波长切换技术。

3.4 方法评价

本研究中建立的HPLC法重复性好,可操作性强,结果准确、可靠,检测效率高,可用于同时测定吴茱萸-桂皮药对中茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸等多组分含量,所建立方法可为吴茱萸-桂皮药对的质量评价提供参考。中药成分复杂,不同药物配伍后特征成分含量可能会发生变化,个别成分消失或有新成分生成,因此,后续可对吴茱萸-桂皮药对进行指纹图谱研究,从而可为合理评价吴茱萸-桂皮药对的质量提供更多参考。

猜你喜欢

桂皮项下吴茱萸
江西道地药材技术创新现状分析与启示
——以吴茱萸为例
种植良种吴茱萸 荒山喜变聚宝盆
货贸项下外汇业务
服贸项下外汇业务
UCP600项下电子签字剖析
信用证项下的退单争议
桂皮和肉桂是不是同一种东西?
桂皮和肉桂是不是同一种东西?
吴茱萸治慢性前列腺炎
桂皮水除口臭