高效液相色谱法同时测定吴茱萸－桂枝药对水煎液中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸含量*

兰 莹，薛 莹，江 阳

（四川省疾病预防控制中心，四川 成都 610041）

吴茱萸－桂枝药对是《金匮要略》中温经汤的核心药对［1］。吴茱萸味苦辛、性温热，有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻功效，常用于治疗呕吐泄泻、厥阴头痛、高血压等［2］。吴茱萸碱、吴茱萸次碱是吴茱萸的主要有效成分［3］，二者具有促进肿瘤细胞凋亡、保护心脏血管系统、调节免疫系统等药理活性［4－6］，其中吴茱萸碱可通过下调NOD1通路诱导肝癌HepG2和SMMC－7721细胞凋亡［7］，吴茱萸次碱能明显防治模型大鼠腹主动脉狭窄所致左室肥厚［8］。桂枝味辛、甘，性温，有散寒解表、温通经脉、平冲降气等功效，常用于治疗风寒感冒、血寒闭经、水肿、心悸等症［9］，桂皮醛、桂皮酸是其主要有效成分，二者可降低血压、抑制肿瘤细胞生长、保护受损的心肌等［10－11］，且桂皮醛可能通过上调肝脏胰岛素信号通路Akt而发挥降血糖作用，并可抑制食管癌鳞状细胞癌细胞Eca109的增殖，促进其凋亡［12－13］，桂皮醛、桂皮酸对缺血性心肌损伤模型大鼠心脏还具有保护作用［14］。因此，检测茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸的含量对于评价吴茱萸－桂枝药对的质量有重要意义。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时检测吴茱萸－桂枝药对水煎液中上述4种成分的含量，为该药对的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity HPLCTM高效液相色谱仪，包括Empower 3.0色谱工作站，四元高压泵系统，在线脱气系统，自动进样器，柱温箱和TUV检测器，数据采集系统（美国Waters公司）；XS215型分析天平、XP6型微量天平（美国Mettler Toledo公司）；KQ－500D型超声波清洗器（上海沪粤明科学仪器有限公司）；KW8672J型离心机（北京京立离心机有限公司）。

1.2 试药

吴茱萸药材（批号为190816）、桂枝药材（批号为186018），均购自郑州张仲景大药房；吴茱萸碱对照品（批号为50890－1806，含量≥99.6%），吴茱萸次碱对照品（批号为280375－181102，含量≥98.9%），桂皮醛对照品（批号为110710－201821，含量≥99.6%），桂皮酸对照品（批号为28573－1914，含量≥98%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil®Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～8 min时7%A→18%A，8～16 min时18%A→36%A，16～25 min时36%A→60%A，25～37 min时60%A→100%A，37～42 min时100%A→7%A，42～47 min时7%A）；流速：1 mL／min；检测波长：215 nm（10～20 min，吴茱萸碱、吴茱萸次碱），290 nm（25～38 min，桂皮醛、桂皮酸）；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸对照品各适量，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得质量浓度分别为2.6420，2.2910，1.9655，1.7088 mg／mL的单一对照品贮备液；各取2.5 mL，置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容，得吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸质量浓度分别为0.26420，0.22910，0.19655，0.17088 mg／mL的混合对照品溶液。按吴茱萸－桂枝药对比例（1∶1，m／m）称取吴茱萸、桂枝各30 g，精密称定，置500 mL圆底烧瓶中，一煎加360 mL水，提取2 h，药液经200目滤布滤过，得一煎水提液。药渣加300 mL水，提取1 h，药液经200目滤布滤过，得二煎水提液。合并两煎水提液，搅拌均匀，静置2 h，得吴茱萸－桂枝药对水煎液630 mL。精密量取25 mL，置离心管中，3000 r／min离心10 min，精密移取20 mL，置蒸发皿中水浴减压蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按吴茱萸－桂枝药对水煎液处方及工艺，制备缺吴茱萸、桂枝的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别取2.2项下3种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应吸收峰，阴性对照无干扰。详见图1。4种成分峰理论板数均大于10000，分离度均大于2。

图1 高效液相色谱图1.evodiamine 2.rutecarpine 3.cinnamaldehyde 4.cinnamic acid A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取2.2项下混合对照品溶液适量，稀释成吴茱萸碱质量浓度为0.0264，0.0528，0.0793，0.5284，0.7926，2.6420 mg／mL，吴茱萸次碱为0.0229，0.0458，0.2291，0.4582，0.6873，2.2910 mg／mL，桂皮醛为0.0196，0.0393，0.0589，0.1966，0.5897，1.9655 mg／mL，桂皮酸为0.0170，0.0342，0.0512，0.1708，0.5126，1.7088 mg／mL的系列混合对照品溶液，各精密量取10 mL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各成分的质量浓度（X，mg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程及线性范围。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n＝6）Tab.1 Results of the linear relation test（n＝6）

精密度试验：取供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果吴茱萸－桂枝药对水煎液中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸峰面积的RSD分别为0.29%，0.06%，0.08%，0.26%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液适量，室温下分别放置0，1，2，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸峰面积的RSD分别为1.33%，0.38%，1.66%，1.08%（n＝7），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品适量，各6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸平均含量分别为0.9819，0.5896，0.2135，0.6798 mg／g，RSD分别为0.81%，1.01%，1.22%，2.15%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n＝9）

2.4 样品含量测定

取样品，按2.2项下方法平行制备2份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg／g，n＝2）Tab.3 Results of content determination of four components in the sample（mg／g，n＝2）

3 讨论

3.1 流动相选择

预试验中分别对甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.05%磷酸水溶液和乙腈－0.1%磷酸水溶液4个流动相系统进行了考察。结果发现，采用乙腈－0.1%磷酸水溶液作为流动相时，各色谱峰的分离度较好，且基线平稳，因此采用乙腈－0.1%磷酸水溶液统作为流动相。

3.2 色谱柱选择

预试验中分别考察了Agilent Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Diamonsil®Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Welch XB C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），结果发现，Diamonsil®Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）效果较好，故以该色谱柱进行试验。

3.3 检测波长选择

对4种成分对照品溶液分别进行紫外－可见全波长（190～400 nm）扫描，发现吴茱萸碱、吴茱萸次碱在215 nm，桂皮醛、桂皮酸在290 nm处有最大吸收，鉴于吴茱萸－桂皮药对中4种成分最大吸收波长不同，为保证各成分在最大吸收波长处检测，提高灵敏度，减少干扰，故本试验中采用了HPLC法波长切换技术。

3.4 方法评价

本研究中建立的HPLC法重复性好，可操作性强，结果准确、可靠，检测效率高，可用于同时测定吴茱萸－桂皮药对中茱萸碱、吴茱萸次碱、桂皮醛、桂皮酸等多组分含量，所建立方法可为吴茱萸－桂皮药对的质量评价提供参考。中药成分复杂，不同药物配伍后特征成分含量可能会发生变化，个别成分消失或有新成分生成，因此，后续可对吴茱萸－桂皮药对进行指纹图谱研究，从而可为合理评价吴茱萸－桂皮药对的质量提供更多参考。