正交试验优选当归药材中阿魏酸提取工艺

陈良胜

（河南省信阳市新县人民医院，河南 信阳 465550）

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，临床常与川芎、白芍、地黄等配伍，常用于活血化瘀。药理学研究表明，当归能模拟小剂量阿司匹林的作用，调节血脂［1］。其有效成分主要为阿魏酸，属酚酸，为桂皮酸的衍生物，一般用其反式体。阿魏酸见光易分解，其水溶液稳定性较差，形成钠盐后稳定性较好，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，难溶于石油醚［2］。阿魏酸的抗氧化性很强，具有抗菌消炎、抑制肝功能损伤等作用。从植物中提取分离天然阿魏酸的方法有碱水解法、酶解法、组织培养法等。目前仍以碱水解法为主，虽有成本低、产量高等优点，但其产生的废渣、废液所带来的环境问题不容忽视［3］。近年来，超临界CO2萃取法、连续回流提取法、高压法、超声波等方法多有应用，但操作烦琐，价格昂贵。闪式提取法在操作方法、能耗、时程、提取效率及应用范围方面均优于传统方法［4－5］。本研究中基于正交试验对当归药材中阿魏酸的闪式提取法进行了优化。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

JHBE－50T型闪式提取器（上海钒帜精密设备有限公司）；LG16－W型离心机（北京离心机有限公司）；755B型紫外－可见分光光度计（四川中浪科技有限公司）；QKCF型超纯水器（南京权坤生物科技有限公司）；Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BT 124 S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；FS－750T型超声仪（上海生析超声仪器有限公司）。

1.2 试药

当归饮片，我院中药房用当归药材（采自海拔超过1000 m的山上，经新县人民医院执业药师殷双兴鉴定为正品）自制；阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为20180423，含量为99%）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸含量测定

2.1.1 色谱条件［6］

色谱柱：TSK－GEL DDS－C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇－水－磷酸（30∶70∶0.3，V／V／V）；流速：1.0 mL／min；检测波长：315 nm；柱温：40℃；进样量：10μL。

2.1.2 溶液制备

取阿魏酸对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成质量浓度为10μg／mL的对照品溶液。取药材样品适量，研磨成细粉，取约0.5 g，精密称定，置有塞250 mL磨口锥形瓶内，加入90%甲醇和盐酸（100∶1，V／V）混合溶液10 mL，称定质量，超声（功率750 W，频率20 kHz）处理0.5 h，再次称定质量，用上述混合溶液补足减失的质量，经0.2μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.1.2项下对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有吸收峰。理论板数按阿魏酸峰计应不低于3000，分离度大于1.5，基线分离良好。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.ferulic acid A.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取对照品溶液1，5，10，15，20，25μL，稀释2倍，制成系列对照品溶液。按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝4573764 X－3878.590，r＝0.9999（n＝6）。结果表明，阿魏酸进样量在0.0070～0.1500μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.1.2项下对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果的RSD为0.39%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2项下供试品溶液适量，室温下分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.20%（n＝6），表明供试品溶液室温下放置3.0 h内稳定性良好。

重复性试验：取药材样品粉末适量，精密称定，共8份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果的RSD为1.10%（n＝8），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品，共6份，加入一定量的阿魏酸对照品溶液，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery tests（n＝6）

2.2 闪式提取法正交试验［7］

以乙醇体积分数（因素A）、料液比（因素B）和提取时间（因素C）为三因素，以阿魏酸含量为评价指标进行L9（34）正交试验。详见表2至表4。由表3和表4可见，因素A、因素C对提取结果有显著影响，影响强度为A＞C＞B，最佳工艺为A2B2C2，即以12倍量70%乙醇，闪式提取1.5 min。

表2 因素水平表Tab.2 The factor levels

表3 正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 方差分析结果Tab.4 Results of ANOVA

2.3 验证试验

取当归药材粉末100 g，按最优工艺进行闪式提取，平行操作3次。结果阿魏酸含量分别为0.2927，0.2930，0.2918 mg／g，平均0.2925 mg／g，与正交设计中的方案6的提取得率接近，RSD为0.21%，表明该工艺稳定可行，具有可操作性和重复性。

2.4 乙醇回流提取法［8］

我国药厂多采用乙醇加热回流提取法提取当归药材中的阿魏酸，现将该法与本研究中优选出的闪式提取法的提取效果进行比较。乙醇加热回流提取工艺中乙醇体积分数及料液比不变，提取次数为3次，提取时间为2.5 h。取3批当归药材样品进行试验，结果闪式提取法和加热回流提取法所得阿魏酸含量分别为0.3324 mg／g和0.2773 mg／g。可见，在各种因素相同的情况下，闪式法提取时间是传统乙醇回流提取法的1／100，且前法所得阿魏酸含量较高。既节省了时间，又降低了能耗。

3 讨论

国内对阿魏酸的提取现多采用传统工艺，具有操作不易、能耗大、费时长、有效成分破坏较多等缺点，导致提取效率低下［9］。本研究中优选闪式提取法的最优提取参数，通过查阅资料及前期的预试验，选用乙醇体积分数、料液比和提取时间为三因素，结合L9（34）正交试验设计对阿魏酸的提取方案进行优化，得最优工艺为乙醇体积分数为70%，料液比为1∶12，闪式提取1.5 min。与传统提取方法相比，闪式提取法所需乙醇体积分数较低，操作简便，提取时间短，提取率高。且该型号电机功率为1800 W，完成1次提取只需1.5 min，与回流提取方法相比，单位能耗明显降低［10］。可见，闪式提取法简单易操作，可为阿魏酸的开发及研究提供参考［11－15］。