BKM120对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的抑制作用*

林城江，陈 冰

（上海交通大学医学院附属瑞金医院药剂科，上海 200025）

卵巢癌为女性常见恶性肿瘤，Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者 经过手术及化学治疗（简称化疗）后，5年生存率仅20%～30%［1－5］。其常规化疗一线药物主要为紫杉醇类与铂类药物。多药耐药性（MDR）是细胞对一种药物产生耐药性的同时，对其他结构和作用靶点类似或不相同的抗肿瘤药物也产生耐药性［6－8］。P－糖蛋白（P－gp）过表达是研究最多的一种多药耐药机制，它是三磷酸腺苷（ATP）依赖性“药泵”，多种多药耐药细胞均可过度表达P－gp，其水平与耐药程度有关。YANG等［9］发现，P－gp和抗凋亡相关蛋白的过表达与卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药相关。磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）信号通路具有调节细胞增殖、分化、凋亡等多种功能，并参与肿瘤的多药耐药［10－12］。BKM120属口服泛Ⅰ型PI3K抑制剂，作用于p110α，p110β，p110δ和p110γ，抑制细胞内Akt的磷酸化，在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长［13－16］。紫杉醇耐药卵巢癌细胞是以大剂量紫杉醇长期作用于卵巢癌A2780细胞后建立的具有稳定紫杉醇耐药性细胞株，即A2780／Taxol细胞。虽有报道称BKM120对卵巢癌A2780细胞增殖有明显的抑制作用［17］，但尚无紫杉醇耐药卵巢癌A2780／Taxol细胞的作用报道。本研究中探讨了BKM120对A2780／Taxol细胞的抑制作用及作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

1.1.1 仪器

CX23型光学倒置显微镜（日本Olympus公司）；371型气套式CO2恒温培养箱（美国Thermo Electron公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；Sp－100UV型紫外分光光度计（英国Unicam公司）；Power Pac 200／MINI型通用电泳仪、MINI－Protean型电泳槽、Trans－Blot SD型半干转膜仪（美国Bio Rad公司）；BX43型荧光正置显微镜（日本Olympus公司）；Tanon 4600型凝胶成像分析仪（中国上海天能科技有限公司）；1－14K型台式低温高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；SW－CJ－1B型净化工作台（中国苏州净化设备厂）。

1.1.2 试药

BKM120（美国MCE公司）；顺铂（DDP，齐鲁制药有限公司）；青霉素（河南新乡华星药厂）；链霉素（吉林济邦药业有限公司）；紫杉醇（哈尔滨三联药业股份有限公司）；DMEM培养液、RPMI－1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，天津市灏洋生物制品科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI，美国Sigma公司）；MTT试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；P－Akt抗体、Akt抗体、Bcl－2抗体、Pro－caspase 3抗体、P－gp抗体、β－actin抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；SDS溶液（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.3 细胞

卵巢癌A2780细胞、紫杉醇耐药卵巢癌细胞A2780／Taxol（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

取A2780细胞适量，培养于含10%FBS、100 U／mL青霉素、100μg／mL链霉素的DMEM培养液中；取A2780／Taxol细胞适量，培养于含10%FBS、100 U／mL青霉素、100μg／mL链霉素、800 ng／mL紫杉醇的RPMI－1640培养液中。2种细胞均在37℃及5%CO2培养箱中培养。每周进行2次传代处理。

1.2.2 BKM120对细胞增殖的影响

采用MTT法。取对数生长期的2种细胞，分别制成密度为105mL－1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔0.1 mL，设溶剂对照组和实验①、②、③、④、⑤、⑥、⑦组。分别置37℃及5%CO2培养箱中培养24 h后加入经RPMI－1640培养液稀释的BKM120，其终浓度分别为0，0.1，0.3，1.0，3.0，10.0，30.0，100.0μmol／L。药物作用24，48，72 h后，每孔加入10μL 0.5%MTT溶液，继续培养4 h。每孔加入100μL 10%SDS溶液，置37℃及5%CO2培养箱中培养过夜。采用酶联免疫吸附检测仪在570 nm波长处检测吸光度值（OD）。平行操作3次，计算细胞增殖抑制率［（1－OD实验组）／OD对照组×100%］。并计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 BKM120对细胞周期的影响

取对数生长期的2种细胞，分别接种到无菌6孔板中，培养过夜，贴壁。设溶剂对照组和实验A，B，C，D组及DDP组，分别以终浓度为0，0.3，1.0，3.0，10.0μmol／L的BKM120和10.0μmol／L DDP培养液作用24 h，收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，并用70%乙醇在－20℃下固定过夜。离心，弃去固定液，然后用PBS洗涤细胞后重悬浮于含100μg／mL的PI，50μg／mL的RNA酶，0.1%的Triton X－100的PBS中，37℃，避光，染色30 min。采用流式细胞仪检测，每份样本采集105个细胞，结果用ModFit软件进行分析。平行操作3次。

1.2.4 BKM120对细胞凋亡的影响

取2种细胞（3.5×105个／孔），分别接种于含高压灭菌盖玻片的6孔培养板中贴壁过夜。分组方法同1.2.3项下，加入不同浓度（0，0.3，1.0，3.0，10.0μmol／L）的BKM120和10μmol／L DDP，作用24 h后弃去培养液。PBS洗1次，加入4%多聚甲醛固定45 min，0.1%Triton X－100冰浴2～3 min，PBS洗涤2次，加入50μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，以50%甘油封片，显微镜下放大200倍观察细胞形态并拍照。平行操作3次。

1.2.5 BKM120对细胞中相关蛋白表达的影响

采用Western blot法。将2种细胞（106个／孔）接种于6孔板中过夜。分组方法同1.2.3项下，加入不同浓度（0，0.3，1.0，3.0，10.0μmol／L）BKM120和10μmol／L DDP处理24 h。吸除培养液，PBS冲洗，吸净PBS，每孔加入100μL Trizol，冰上裂解20 min，收集细胞，置1.5 mL EP管中，4℃下12000 g离心5 min，取上清液，以Lowry法检测蛋白含量。各组取50μg上样，根据蛋白分子量以8%或12%SDS－PAGE电泳后半干转，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉（含0.1%吐温20）室温封闭1 h，加入一抗4℃封闭孵育过夜，TBST清洗4次，每次8 min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温振摇2 h，回收二抗，用含0.1%吐温20的TBST清洗4次，每次8 min。加入ECL化学发光试剂，将PVDF膜放入暗盒中，压上X胶片，取出胶片后显影、定影、清洗。以凝胶成像仪扫描，分析目的条带与内参条带的灰度比值，即为各目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 BKM120对细胞增殖的抑制作用

用0.1～100μmol／L的BKM120处理A2780细胞和A2780／Taxol细胞24，48，72 h，1μmol／L BKM120作用24 h有明显的增殖抑制作用，且随着时间的延长作用增强。BKM120对A2780细胞的IC50为（2.25±0.13）μmol／L，对A2780／Taxol细胞的IC50为（4.17±0.43）μmol／L。详见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝3）Tab.1 Comparison of the inhibition rate of cell proliferation in each group（±s，%，n＝3）

表1 各组细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝3）Tab.1 Comparison of the inhibition rate of cell proliferation in each group（±s，%，n＝3）

注：与溶剂对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。Note：Compared with those in the solvent control group，*P＜0.05，**P＜0.01，as well as the following tables.

A2780细胞 A2780／Taxol细胞组别浓度（μmol／L）00.10.31.03.010.030.0100.0溶剂对照组实验①组实验②组实验③组实验④组实验⑤组实验⑥组实验⑦组24 h 00.00±0.000.43±2.4814.50±9.96**27.92±3.10**39.25±6.55**34.72±4.22**41.09±5.40**48 h 06.08±3.8716.31±3.71*30.25±1.58**58.58±1.86**78.18±1.87**76.24±1.40**81.29±2.05**72 h 00.90±1.013.20±3.5426.57±14.70**62.94±11.61**86.02±6.65**81.15±7.88**88.92±6.42**24 h 00.80±0.803.01±4.277.12±0.37*14.71±1.02**11.49±5.83*10.81±5.11**25.02±5.07**48 h 02.81±1.419.68±3.84*19.80±3.81**42.73±6.56**58.15±3.26**55.20±1.30**64.66±4.36**72 h 00.80±1.011.10±1.3413.52±4.41**51.53±9.50**70.83±0.72**73.73±1.60**79.58±1.78**

2.2 BKM120对细胞周期的影响

A2780细胞和A2780／Taxol细胞在BKM120作用24 h后出现G1期细胞减少，G2期阻滞，且具有剂量依赖性。从3.0μmol／L开始，实验组与溶剂对照组G2期细胞数有显著差异（P＜0.01）。详见表2、图1。

表2 各组细胞周期阻滞情况比较（±s，%，n＝3）Tab.2 Comparison of cell cycle arrest in each group（±s，%，n＝3）

表2 各组细胞周期阻滞情况比较（±s，%，n＝3）Tab.2 Comparison of cell cycle arrest in each group（±s，%，n＝3）

组别溶剂对照组实验A组实验B组实验C组实验D组DDP组浓度（μmol／L）00.31.03.010.010.0 A2780细胞 A2780／Taxol细胞G184.67±3.6687.47±0.9691.23±1.2646.61±5.81**49.30±5.40**56.63±8.34**S S 9.72±1.698.02±0.615.08±0.71*12.45±6.05*10.33±2.3340.31±6.83**G25.60±2.824.51±0.893.69±0.5640.93±3.71**40.38±6.12**3.06±1.52 G151.11±6.3151.03±7.6356.33±11.6621.72±8.10**21.17±7.84**25.50±5.87**29.14±6.5031.43±5.4928.18±7.1618.19±4.84**8.53±1.54**53.15±15.84**G219.75±9.8617.54±8.5315.50±6.4260.09±6.23**70.29±6.30**21.37±10.42

2.3 BKM120对细胞凋亡的诱导作用

BKM120作用于A2780细胞和A2780／Taxol细胞24 h后，细胞基因组DNA发生断裂，末端3′－OH显露出来，可在末端脱氧核苷酸转移酶作用下添加荧光素标记的dUTP，显微镜下观察呈现绿色荧光（见图2）。BKM120诱导细胞凋亡呈剂量依赖性，经LSD－t检验，从0.3μmol／L开始，实验组与溶剂对照组间有显著差异（P＜0.01）。详见表3。

表3 各组细胞凋亡率比较（±s，%，n＝3）Tab.3 Comparison of the apoptosis rate in each group（±s，%，n＝3）

表3 各组细胞凋亡率比较（±s，%，n＝3）Tab.3 Comparison of the apoptosis rate in each group（±s，%，n＝3）

组别溶剂对照组实验A组实验B组实验C组实验D组DDP组浓度（μmol／L）00.31.03.010.010.0 A2780细胞1.56±0.6615.09±3.34*23.76±3.78**42.00±3.84**43.28±2.22**19.92±2.14**A2780／Taxol细胞4.50±1.5912.29±6.07**18.20±3.55**29.58±4.33**30.79±4.54**17.69±2.03**

图2 细胞光镜图a.solvent control group b－e.experiment groups A，B，C and D f.DDP group A.A2780 cells B.A2780／Taxol cellsFig.2 Light micrograph of cells

2.4 BKM120对细胞中相关蛋白表达的抑制作用

BKM120可下调P－Akt蛋白的表达，并呈浓度依赖性。3μmol／L BKM120作用于A2780细胞和A2780／Taxol细胞24 h能显著降低P－Akt蛋白表达水平，但对Akt蛋白表达水平无影响；BKM120可显著降低Bcl－2和Pro－caspase 3蛋白表达水平，说明BKM120能抑制Bcl－2蛋白表达，促进caspase 3蛋白表达。详见图3、表4。

2.5 BKM120对A2780／Taxol细胞中P－gp蛋白表达的抑制作用

BKM120下调P－gp蛋白的表达，并呈浓度依赖性。3μmol／L BKM120作用于A2780／Taxol细胞24 h能显著下调P－gp蛋白表达。详见图3、表4。

表4 各组蛋白表达水平比较（±s，%，n＝3）Tab.4 Comparison of the expression levels of protein in each group（±s，%，n＝3）

表4 各组蛋白表达水平比较（±s，%，n＝3）Tab.4 Comparison of the expression levels of protein in each group（±s，%，n＝3）

组别溶剂对照组实验A组实验B组实验C组实验D组DDP组浓度（μmol／L）00.31.03.010.010.0 A2780细胞 A2780／Taxol细胞P－Akt／Akt 100.00±0.0080.24±4.0584.77±6.9667.67±5.21**43.20±3.74**82.57±3.28 Bcl－2100.00±0.0098.57±2.7685.68±3.1775.79±2.09*63.64±3.46*60.38±8.64**Pro－caspase 3100.00±0.0097.94±1.2696.99±1.7781.74±2.31*73.19±4.31**81.33±7.34*P－Akt／Akt 100.00±0.00102.10±6.6497.60±5.9654.26±2.16**46.15±1.46**84.44±2.98 Bcl－2100.00±0.0094.78±1.04102.80±1.7274.37±2.20*72.81±1.57**89.77±1.49 Pro－caspase 3100.00±0.0095.62±2.5188.15±2.6175.24±0.64**79.36±1.92**77.82±2.14**P－gp 100.00±0.0097.02±1.3398.19±1.7083.12±2.31*81.59±3.45*80.44±3.30*

图3 蛋白电泳图a.solvent control group b－e.experiment groups A，B，C and D f.DDP group A.A2780 cells B，C.A2780／Taxol cellsFig.3 Protein electrophoresis

3 讨论

PI3K为一种由调节亚单位p85或p101和催化亚单位p110组成的脂激酶，通过催化PIP2，使其发生磷酸化，转化为PIP3，激活下游Akt等［18］。Akt磷酸化活化使许多蛋白质磷酸化，调节细胞活动。研究表明，PI3K／Akt信号通路在多种恶性肿瘤中表达异常，如卵巢癌、乳腺癌、肝细胞癌、肾癌、前列腺癌、淋巴瘤等。在PI3K／Akt信号通路中涉及多个基因，如PIK3CA，Akt1，PTEN等发生突变［19－23］。

本研究结果表明，BKM120抑制A2780细胞和A2780／Taxol细胞的增殖，其作用呈剂量和时间依赖性，IC50均较低，说明其起始有效作用浓度较低，预示有较好的安全性；细胞周期检测结果表明，BKM120可使大部分A2780细胞和A2780／Taxol细胞阻滞于G2期，降低肿瘤细胞的增殖速率；TUNEL荧光染色结果显示，BKM120诱导A2780细胞和A2780／Taxol细胞的凋亡，并呈剂量依赖性，可显著杀伤肿瘤细胞；Western blot实验结果表明，BKM120下调了Akt蛋白磷酸化水平，转运蛋白P－gp和抗凋亡蛋白Bcl－2在A2780／Taxol细胞中表达水平降低。另外，caspase 3的活化在凋亡发生的过程中发挥着重要作用。研究发现，BKM120下调了Pro－caspase 3的蛋白表达，表明BKM120通过抑制Akt蛋白的磷酸化，Bcl－2的表达和激活caspase 3诱导A2780／Taxol细胞凋亡，同时还有效抑制了转运蛋白P－gp的表达，显著减少了紫杉醇耐药肿瘤细胞的药物外排作用，为之后的联合用药提供了很好的条件。

综上所述，BKM120可抑制A2780细胞和A2780／Taxol细胞的增殖，并通过下调Akt蛋白的磷酸化水平和抑制转运蛋白P－gp的表达，降低Bcl－2蛋白表达水平，激活caspase 3诱导细胞凋亡。本研究为未来临床使用BKM120治疗耐药卵巢癌提供了一定的理论依据。