三维打印结合组织工程技术在下颌骨缺损重建的临床前研究进展

刘 涵 邱 林 刘 浩 张 军 李瑞欣

作者单位：300041天津市口腔医院/南开大学口腔医院，天津市口腔功能重建重点实验室（李瑞欣、张军为通讯作者）

三维（3D）打印技术是一系列快速成型技术的统称，其原理是指在计算机控制下，根据物体的计算机辅助设计（CAD）模型或计算机断层扫描（CT）等数据，通过材料的精确逐层3D堆积，快速制作形状复杂的物体[1]。组织工程是近年来正在兴起的一门新学科，属于生物高技术范畴，主要是将细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内组织或器官的构建。本文通过广泛查阅相关文献，总结下颌骨缺损重建中不同3D打印材料、打印工艺、打印结构设计对修复体成骨状况和机械性能的影响，对骨支架研发的难点和热点进行分析，希望为新型下颌骨缺损修复支架的研发提供参考。

一、下颌骨缺损修复概况

因肿瘤或创伤等引起的下颌骨缺损发生率较高，下颌骨缺损会对患者的容貌、言语和咀嚼功能造成不良影响，其修复重建除了对形态的恢复要求较高外，还需要有足够的机械强度来承担周围软组织和后期义齿修复或种植体植入后的长期压力，这在一定程度上增加了下颌骨缺损修复的难度。

目前临床上主要采用自体腓骨、髂骨游离移植来进行下颌骨缺损区域的修复，虽然能在一定程度上恢复患者的面型和功能，但该方法既造成供区新的创伤，又存在手术时间长，塑性不良等缺陷[2]。近年来逐渐出现在传统自体骨移植术基础上使用3D打印技术制作下颌骨截骨导板、供区截骨及塑形导板来辅助手术进行，导板既可以简化手术过程、降低手术并发症，又能达到精确重建的目的，在临床上已成功推广应用并取得了良好的效果[3]。

自体骨移植术因始终存在损伤供区，降低患者生存质量等问题，难以再进一步完善。随着3D打印技术的发展和材料学的进步，骨组织工程技术也开始逐渐应用到骨缺损重建中，这为下颌骨缺损重建带来了新的可能。近年来快速成型技术工艺得到进一步发展和完善，不仅可以打印解剖形态高度仿真的个性化下颌骨修复体，其所具备的数字设计和数字制造工艺还可以实现支架的最优化结构设计及复合材料打印[4]，使得越来越多关于下颌骨重建的研究已经转向组织工程领域。其潜在的优势不仅包括减少患者损伤、缩短手术时间和精确恢复外形，还可以通过组合各种材料、干细胞、生长因子以及优化结构设计来更好的实现功能重建[5，6]。

二、骨组织工程支架材料的选择

在运用3D打印技术制备骨组织工程支架时材料的选择是至关重要的。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，所以用于骨支架制备的3D打印材料不仅应具备良好的可打印性，还必须具备生物相容性、可成骨性及良好的降解性能。此外因支架是用于下颌骨的缺损修复，材料选择时还必须具备足够的机械强度用于承担周围软组织和后期义齿修复或种植体植入后的长期压力。现有的单一材料往往无法满足下颌骨复杂的性能要求，因此研究多为具备几种不同性能的材料混合打印或负载生长因子等以提高材料的综合性能，满足重建需求。以下对用于骨组织工程支架制备的各种3D打印材料进行介绍。

1.金属钛合金材料

用于3D打印的金属材料钛合金因具有良好的机械性能一直是生产骨科植入物的最佳选择。张庆福等[7]用3D打印钛合金修复体进行一例下颌骨角化囊肿病例后下颌骨修复重建工作，修复体在解剖形态上完全达到仿真效果，使得解剖形态各异的下颌骨修复体的设计制作和临床应用成为现实。Peng Li[8]等制备了多孔钛支架，通过力学性能分析发现其杨氏模量和抗压强度与骨结构相近，并且具有良好的生物相容性和骨整合能力，具有潜在的临床应用价值。复合其他材料及生长因子可提高钛网成骨性能，例如通过喷涂羟基磷灰石（HA）对多孔钛修复体表面进行生物活化改性可增强骨整合能力，提高植入后稳定性；复合人骨形态发生蛋白（BMP-2）等生物刺激物可以加速骨重建[9]。虽然钛合金目前仍然是骨修复植入体的主流材料，但其存在的应力屏蔽、骨整合力不足、局部腐蚀及缺乏降解性等问题是造成植入体松动与失效的潜在风险。随着再生医学及材料学的进步，更多天然生物及合成高分子材料被进一步研究。

2.天然及合成高分子复合材料

天然生物材料如胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖等，其本质上是多糖或蛋白质，类似于天然的细胞外基质（ECM），具有良好的细胞相容性、低免疫原性及可降解性，是修复植入的理想材料[10，11]。羟基磷灰石（HA）[12]作为人体骨的主要成分，具有良好的骨传导性，可提高复合材料的力学性能，也是骨科修复材料的理想选择。唐鸣等[13]将预制的多孔丝素蛋白支架原位植入兔下颌骨临界性骨缺损中，骨缺损腔表面完全被新生骨覆盖，材料无脱出，表明多孔丝素蛋白支架用于原位组织工程修复骨缺损具有一定可行性。复合羟基磷灰石可明显提高丝素蛋白骨修复材料的力学性能，提高成骨活性[14]。

合成材料如聚己内酯（PCL）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等用于颌面缺损修复主要归因于其易成孔、可降解性和良好的力学性能，但是需要通过改性提高其细胞粘附性[15]。Christopher D[16]等用100%β-磷酸三钙制成三维打印陶瓷支架并用于治疗兔下颌骨节段性缺损，组织学检测及CT成像显示该支架适合缺损修复，具备良好的成骨能力。Po-Chun Chang等[17]将90%羟基磷灰石和10%聚乳酸-羟基乙酸组成的支架材料植入大鼠下颌的穿透性骨缺损处，发现支架具有可接受的尺寸稳定性和良好的骨再生能力。Lee[18]等以犬下颌骨为模型，采用多头沉积系统制备了聚己内酯/β-磷酸三钙（PCl/β-TcP）支架，证实了其在下颌骨重建中的潜力。Wei[19]等采用冷冻干燥法制备了锌（Zn）掺杂羟基磷灰石微球（Zn-MHMs）的胶原支架，设计用于模拟骨小梁，显示支架有促进骨再生的作用并且Zn-MHMs在药物输送方面是有效的。

以上表明将不同材料共混打印制备复合支架可以弥补单一材料的性能不足，并满足了生物活性、机械强度、易于制造和可控降解的各种要求，是构建新型组织工程支架的一种很有前途的途径。

3.复合细胞或生长因子的生物材料

支架负载细胞或生长因子可提高支架的骨整合能力。Michael G[20]等采用选择性激光烧结法打印梯形聚醚酮酮（PEKK）多孔支架并复合脂肪来源干细胞（ADSCs），然后将其植入新西兰兔下颌骨缺损中，结果表明三维打印的PEKK支架与ADSCs结合，为下颌骨重建后改善骨-种植体界面、提高咀嚼时受力提供了一种很有前途的解决方案。Matthew K[21]等将PLGA单独支架及与骨形态发生蛋白（BMP-2）和脂肪来源干细胞（ASCs）复合支架用于大鼠下颌骨临界大小节段性缺损修复的比较研究，证实携带成骨因子的仿生支架诱导临界大小的下颌骨节段性缺损愈合的效果最好。Nan Deng[22]等采用三维打印技术将载人骨形态发生蛋白-2的壳聚糖（CS/rhBMP-2）纳米缓释载体与聚乳酸/纳米羟基磷灰石（PLGA/nHA）支架复合制备组织工程化骨支架复合体，PLGA/nHA/CS/rhBMP-2支架复合物有效地控制了rhBMP-2的早期破裂效应，具有良好的生物相容性和诱导成骨作用，成功修复了兔下颌骨实验性骨缺损区。Wenhai Zhang[23]等制备了负载双重生物活性小分子（白藜芦醇和雷诺酸锶）的三维打印PCL/水凝胶复合支架并植入到具有临界大小的下颌骨缺损的大鼠模型中，发现含有双重小分子的骨支架在促进血管生成和抑制破骨细胞活性方面具有联合优势，并且它们协同促进成骨分化。

生物材料辅助的下颌骨重建能以可控和扩展的方式将抗生素局部释放到下颌骨缺损处，以预防和治疗感染，打印支架载抗肿瘤药物、生长因子、细胞、光热材料或其他生物材料可使其修复缺损的同时也具备一定的抗肿瘤、抑菌、成骨等功效，提高了支架的综合性能，有望为肿瘤引起的颌骨大范围缺损探索出一条新的理想修复途径。

三、3D打印技术的选择

1.常用的3D打印技术

3D打印技术的选择依赖材料的固有特性，其中金属粉末的熔接主要依靠选择性激光熔化（SLM）和选择性电子束熔化（SEBM）技术，这两种工艺都能够完成高精度的复杂设计，因具有尺寸精度好、构建分辨率高、构建环境干净、节省材料、可定制化程度高等优点，在金属材料3D打印修复骨缺损方面显示出巨大的潜力[24]，下颌骨钛网打印多是应用此技术。

非金属材料，特别是树脂类材料主要采用光固化成形技术（SLA）进行打印，SLA可以创建高分辨率和精确的几何形状，已被广泛用于制作骨组织工程支架[25]；陶瓷材料打印目前主要依靠直接挤压式的三维打印技术，该技术操作简便且应用广泛[26]；热塑性材料可采用熔融堆积成型技术（FDM）进行打印，通过对温度的控制可对打印出的模型材料进行固定，利用FDM对PCL、聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等热塑性材料进行快速成型是获得3D颌骨模型的一种准确、可重复性和符合灭菌要求的方法，FDM在制作颌骨截骨导板时有较多应用，但因为操作时的温度相对较高，FDM不能支持进行细胞或对温度敏感的生物材料进行同时打印[27]。

复杂三维结构产品的制造依赖于打印技术的进步，如何提高打印技术满足复合材料的打印需求及实现高精度打印是需要进一步深入研究的。

2.优化3D打印技术

3D生物打印是近年来的研究热点，可用于精确分配细胞负载的生物材料，制造细胞分布可控的支架，用于构建复杂的3D功能活组织或人工器官，目前的3D生物打印机大多采用挤压式生物打印技，3D生物打印技术为构建具有复杂结构和生物活性成分的骨组织工程构筑物提供了一种很有前途的工具[28]。

双光子聚合（TPP）微细加工技术因其在微观和纳米尺度上具有高分辨率的制造能力，在组织工程和药物输送方面有很高的价值，其中三维水凝胶的设计和制备一直是TPP微细加工的一个重要研究领域[29]。

Alexander M等[30]将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）生物材料进行3D打印制成体内生物反应器，在不添加外源生长因子或细胞的情况下，生成具有定制几何形状的大型自体血管化骨组织，这些组织随后被成功地进行了外科移植用于修复绵羊下颌骨的大块缺损，这是3D打印技术间接成功修复下颌骨缺损的成功应用。

近年来逐渐出现了混合3D打印技术，这可以在一定程度上弥补单一3D打印机的技术不足[31]，通过多通道打印可以实现天然高分子水凝胶与合成材料的交替打印及浓度梯度打印，克服天然、合成高分子材料共混打印的不足，有望制备出具有良好力学性能和生物活性的结构形状可控的3D打印复合材料，满足下颌骨修复支架打印的需求。

四、结构设计对3D打印支架性能的影响

1.孔隙对成骨效果的影响

天然骨的内部为松质骨，具有相互贯通的孔隙结构，孔隙是骨组织形成所必需的，它们允许成骨细胞和间充质细胞的迁移和增殖，以及血管化[32]。支架的孔隙率和孔径对骨形成起着至关重要的作用，从现有的研究来看，孔隙率应满足50%～90%，孔径在300～500μm之间更有利于骨重建[27，33]。

通过改变打印丝条直径，角度等参数可以调整孔隙结构定量化的研究与力学性能及成骨效果的关系[34]。Kuboki等[35]使用大鼠异位模型，羟基磷灰石陶瓷作BMP载体诱导骨形成：结果表明无孔隙结构上没有新骨形成，而在多孔支架中发生了直接成骨，证明了骨再生中孔隙的必要性。Hofmann等[11]制备了不同孔径的丝素支架，并植人HMSC，发现较小孔径支架含有更多的表面积以及更多的骨小梁结构，但孔径较大的支架更有利于细胞的增殖。Akay等[36]研究了成骨细胞在聚羟基异丙基醚聚合物（PHP）中的行为，发现较大的孔隙促进细胞浸润的能力超过了较小的孔隙提供的较大的初始细胞附着表面积的有利影响，同时较大的孔径会促进整个支架的血管生成[37]。高孔隙率的支架在骨组织工程中具有潜在的应用前景，但过高孔隙会降低支架的机械强度，影响后期骨形成，用具有高固有机械强度的材料可能是这一问题的一种解决方案[38]。

总之设计制造多孔结构可提高材料的骨整合能力、提高复杂结构植入体的加工效率、辅助实现高难度设计和高制造精度，对骨修复体制备是至关重要的。

2.三维结构对力学性能的影响

三维网状结构不仅可以模拟天然骨的内部结构，为细胞和血管长入及营养物质代谢提供空间，还可以改善植入生物材料和周围天然骨之间的机械联锁，提高其机械稳定性，已成为骨组织工程支架的基本结构[39]。随着打印工艺的进步，3D打印不仅可以个性化恢复下颌骨的外形，还可以通过调整支架的结构设计，改变其力学性能，以最大限度地实现功能重建[40]。

通过3D打印技术，支架的内外结构，包括孔形状、孔隙率和互连性，可以被严格控制，以实现高度的结构复杂性、灵活性和患者特定的需求[41]。刘云峰[42]提出了一种基于组织工程的人体下颌骨缺损修复支架数字模型生成方法。采用基于三角网格的数字化设计方法进行缺损区域建模和计算，实现缺损区的原始形状再现和支架设计和制作的微观结构可控。高慧[43]等制备了不同构型和不同支柱直径的修复体，应用有限元分析和骨“力矩”理论进行优化测试，结果表明结构形式与荷载传递能力之间有很强的相关性。Hui Mei等[34]研究了不同打印角度的复合材料力学性能，证实[0°、45°、90°]的打印角度表现出最高的拉伸强度和模量。有研究表明渗透性也是显著影响组织再生和存活的关键，有必要将径向渗透率作为支架孔结构设计的一种更现实的计算工具[44]。

有限元分析法自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于人体骨组织生物力学的研究，用有限元力学分析软件对下颌骨进行生物力学分析，并根据生物力学分析结果进行网状结构的优化制备梯度结构，是提升下颌骨缺损修复效果的有效途径[45]。总之，3D打印技术正在快速进步，其在开发具有可控孔径、梯度孔结构以优化组织再生的生物支架方面有很大应用潜力。

五、结论和展望

受目前制作工艺水平的限制，高精度的仿生设计还难以完全实现，且材料的安全性，在人体内降解代谢水平还未充分证明。用于下颌骨修复的骨支架仍处于基础研究水平，对生物材料、打印技术、仿生力学、计算机技术等方面都需要进一步探索，距应用于临床工作中还有较远距离。总之，3D打印技术及骨组织工程支架是一个正在快速发展的研究领域，未来将出现更多新型快速成型技术和生物打印材料，微观结构也将得到进一步优化，这一切使得3D打印技术在下颌骨缺损重建中有着广阔的应用前景和可能性。最终，这些3D打印的骨组织工程支架会成为给那些患有下颌骨缺损的病人提供改善生活质量机会的关键。