肝癌免疫治疗联合放射治疗进展

刘佳妮 徐西伟 邓云 陈少亿 张可

一、肝癌治疗背景及现状介绍

肝癌是男性癌症死亡的第二大原因，在全球男女癌症死亡率中高居第四位。肝癌中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占75%～85%，其发病原因主要为肝炎病毒感染、酗酒和肥胖等[1]。慢性肝炎发展至肝硬化从而导致门脉高压的发生，进一步创造了利于肿瘤生长的低氧环境[2]，其还能通过减少先天免疫蛋白和模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）的合成来损害肝脏内的免疫监视，反过来破坏肝脏巨噬细胞（Kupffer cell）和窦状内皮细胞的抗原呈递和吞噬能力，从而在患者体内形成免疫缺陷环境，并促进肝癌的发生[3]。

早期HCC的根治性治疗包括手术切除或肝移植，预期5年生存率在60%～80%。但是，只有不到20%的HCC患者能接受这些治疗。无法接受根治性治疗的患者建议局部治疗，例如射频消融、化学疗法或放射栓塞术，以控制疾病局部进展[4]。对于不可切除的晚期HCC，推荐使用全身治疗，如酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI），该类药物有索拉非尼等。乐伐替尼（Lenvatinib）是晚期HCC的另一种一线治疗选择，与索拉非尼相比，在中位总生存期（overall survival，OS）方面差异不大，但无进展生存期（progression-free survival，PFS）和客观缓解率（objective response rate，ORR）有优势。瑞戈非尼、卡博替尼和雷莫芦单抗是疾病进展的晚期HCC患者的二线治疗方案[9]。近年来，免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）已成为晚期肝癌患者的希望[5]。在晚期HCC中使用抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）抗体的Ⅱ期和Ⅲ期ICB试验均已证明具有临床益处，并且发生与治疗相关的严重不良事件的发生率较低[6]。在2020年3月FDA批准将伊匹单抗（ipilimumab） （抗CTLA-4）与纳武单抗（nivolumab） （抗PD-1）联合用于索拉非尼患者。除了多种ICB的组合外，越来越多的证据表明放疗在增强肿瘤免疫力中起着重要作用。如临床前研究表明放射治疗(radiotherapy，RT)和ICB的组合可以协同增强两种治疗方案诱导的抗肿瘤反应[7]。在本综述中，我们将讨论RT和ICB对肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)的影响，以及这种联合疗法如何协同控制HCC进展。

二、HCC的免疫微环境和免疫治疗

慢性肝炎感染或长期肝损伤常常使肝脏处于慢性炎症状态。适度的炎症可提供针对病原体的保护作用，并修复组织损伤，然而，持续的肝脏炎症会扰乱微环境从而促进癌变。如肝脏中分泌的细胞因子和趋化因子可以促进血管生成、免疫逃逸和抗凋亡反应，并募集具有创造促进肿瘤生长的微环境能力的免疫细胞[8]。与邻近的非肿瘤或健康肝脏组织相比，抗炎细胞因子白介素10（interleukin-10，IL-10）已被证明在HCC肿瘤组织中高度富集。高水平的转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）也与晚期HCC的肿瘤侵袭性增加相关[9]。肿瘤相关的细胞因子和趋化因子能够募集并使免疫亚群极化并分化为促肿瘤表型，从而促进肿瘤发生。此类免疫亚型之一是肿瘤相关的巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM），可通过TME中存在的IL-10，TGF-β，IL-4或IL-13极化为M2巨噬细胞表型，并通过支持血管生成来驱动肿瘤进展和募集调节T细胞（regulatory cells，Tregs）[10]。TAM在肿瘤区域的积累通常与包括HCC在内的多种癌症类型的预后不良相关。此外，调节或抑制CD8（+）T细胞活化和细胞毒性能力的Treg在促进肿瘤发生中也起着关键作用。另外，IL-17也和HCC患者的较差预后相关[11]。HCC中富含TGF-β的TME有助于辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）的分化，Th17是产生IL-17的白细胞分化抗原4阳性（cluster of Differentiation，CD4） （+）辅助T细胞亚群。Th17在肿瘤内的富集与HCC患者的微血管浸润以及较差预后呈正相关[12]。另一方面，能够产生γ干扰素（interferon γ，IFN-γ）的CD4（+）T辅助细胞1（Th1）可以激活树突状细胞，从而促进CD8（+）T细胞的启动和成熟。Th1还可以通过干扰素依赖性机制触发树突状细胞（dendritic cell，DC）介导的肿瘤杀伤作用，并进一步增强下游的抗肿瘤免疫反应[13]。经肝动脉化疗栓塞治疗后，HCC患者的Th1反应增强，其与预后良好相关[14]。尽管Th1具有抗肿瘤能力，但与正常健康肝脏相比，研究发现2型CD4（+）T辅助细胞（Th2）在HCC组织中富集，并且与HCC患者的总生存率呈负相关。Th2细胞因子，例如IL-4、IL-10以及IL-13能够诱导M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞具有抑制CD8（+）T细胞介导的抗肿瘤活性作用[15]。Th2细胞因子的上调和丙型肝炎病毒诱发的HCC的可能性增加相关。CD8（+）组织驻留记忆T细胞（tissue- resident memory，Trm）、CD8（+） 效 应 记 忆T细 胞（effector memory，Tem）和自然杀伤（natural killer cell，NK）细胞等细胞毒性免疫细胞在抗肿瘤免疫中也起着关键作用。然而有报道指出与来源于非肿瘤区域的NK细胞相比，在HCC的肿瘤区域内发现的NK细胞显示出较差的细胞溶解能力和较少的IFN-γ的产生[16]。尽管Trm和Tem细胞的存在与HCC的预后良好相关，但它们经常表达诸如PD-1、淋巴细胞激活基因 3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）之类的免疫耗竭标志物，这些标志物与其功能呈负相关[17]。因此，这些耗竭标志物已成为ICB激活和恢复CD8（+）T细胞功能的主要靶点[28]。

免疫疗法在HCC的获益在几篇综述[18-19]中进行了大量讨论。特别是在ICB，针对PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制剂也在HCC的临床试验中进行了大规模验证。肿瘤细胞上PD-L1表达的上调，特别是其与肿瘤浸润性活化T细胞表达的PD-1结合后，能诱导耗竭并抑制这些效应细胞的抗肿瘤免疫活性，从而允许肿瘤细胞的免疫逃避。抑制PD-1/PD-L1相互作用可以逆转这些细胞毒性免疫细胞的耗竭状态，并恢复其抗肿瘤活性[20]。在两项临床试验中，ICB在晚期HCC的临床益处是显著的，总体有效率更高[23]。另一种备受关注的ICB是CTLA-4，与PD-1/PD-L1途径不同，CTLA-4主要在T细胞启动阶段向上游作用，并因此具有更多的不良事件。临床前和临床研究都表明，抗CTLA-4的给药通过减轻Tregs的免疫抑制作用直接诱导CD4（+）和CD8（+）效应T细胞[21]。最近FDA批准了ipilimumab（抗CTLA-4）和nivolumab（抗PD-1）用于既往接受过索拉非尼治疗进展的晚期HCC患者[14]。尽管观察到ICB疗法在广泛的肿瘤中取得了初步的成功，但在经历了ICB治疗的初始反应后其疗效有所下降并且出现了获得性耐药的现象，已有研究对HCC患者这种变化的反应率进行了深入的研究[22]。

三、HCC的放射治疗进展

既往的HCC放疗因为全肝照射的耐受剂量有限，而无法达到肿瘤部位理想的放疗剂量[23]。随着放疗技术的进步，能够实现肿瘤部位的高剂量辐射的同时，限制对周围正常组织的损害，如体部立体定向放射治疗（stereotactic body radiation therapy，SBRT）和放射栓塞（radioembolization，RE）技术。由于定位成像、放疗计划和传输系统技术的进步，SBRT能够在较少的放疗次数下达到较大分割的外照射剂量[9]。相比之下，放射性内照射是一种内部放射技术，主要利用β射线，通过肝动脉将放射性标记（如Y90）的微栓塞颗粒直接引入HCC，从而限制组织穿透范围。这些进展扩大了HCC治疗的放射治疗应用范围[7]。SBRT被证明有着良好的肿瘤控制率，两年局部控制率在84%～95%。然而，其总体生存率受到肝内照射野外以及其他部位的肿瘤进展的限制[24]，这突出了同时进行系统性疾病控制的必要性。SBRT因放疗技术的进步，能够对正常组织进行保护使其显示出良好的耐受性。由于其总体疗效和安全性，这些放射疗法现在已被更广泛地用于肿瘤的局部控制和过渡/降期治疗中，以利于后续根治性治疗的进行，如移植或切除[25]。传统上，放疗治疗癌症的基本原理是用高能粒子诱导肿瘤细胞致命的DNA损伤，导致随后的细胞死亡。另外，在对肿瘤靶病灶进行电离辐射治疗后，非治疗部位的远位肿瘤也有缩小，这种放射治疗引发免疫介导的抗肿瘤反应能力的现象被称为“远位效应”，这种现象在最近10年越来越受到关注。RT引起免疫原性细胞死亡和细胞应激，增加了肿瘤相关抗原暴露和促进损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），反过来亦能激活树突状细胞。一种专业的抗原呈递细胞，可激活肿瘤特异性CD8（+）T细胞，进一步增强抗肿瘤反应，促进免疫细胞渗透到TME[26]。研究表明，在HCC经历SBRT、Y-90-RE后，不同肿瘤类型的抗原呈递活性有所增加。例如PRRs在识别DAMPs后，会激活干扰素基因（stimulator of interferon genes，STING）通路的刺激因子，介导激活下游免疫反应的I型干扰素(IFN-α和IFN-β)的产生[27]。临床前和临床研究均报告了辐射诱导免疫反应的进一步证据，观察到了抗肿瘤免疫亚群如CD4（+）、CD8（+）T细胞、NK和NKT向TME的激活和募集增加的现象。总之，这些发现与RT可以将免疫原性低、免疫细胞浸润少的“冷”肿瘤转化为免疫反应性“热”肿瘤的观点一致，后者被证明免疫细胞浸润良好。尽管最初有免疫激活现象，但RT可以间接导致随后的免疫抑制效应，如后续招募Tregs和TAMs到TME。辐射诱导的干扰素活性也可引起肿瘤浸润细胞毒性T细胞耗竭分子或信号通路的上调[28]。研究表明，在HCC患者中用Y-90-RE治疗后，CD8（+）T细胞耗竭增加，表现为T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin 3，Tim-3）和PD-1的表达。其他研究也观察到，放疗可导致肿瘤细胞上调PD-L1表达，这可以减弱抗肿瘤反应[29]。免疫抑制反应压制了抗肿瘤免疫反应，肿瘤细胞破坏免疫监视，并最终导致放疗抵抗。因此，免疫治疗的联用对规避这种放疗抵抗和提高放疗的临床获益是非常必要的。

四、RT和ICB联合治疗

将放射治疗和免疫治疗结合基于以下原理：放射线增加了抗原的暴露，可以激活免疫系统，并产生协同的抗肿瘤免疫力来持久地控制肿瘤。其中钙结合蛋白钙网蛋白的存在是促进吞噬作用的关键信号，辐射能促进钙网蛋白从内质网向质膜的转运。同时，触发抗吞噬信号CD47的蛋白可能会在放射线照射后下调[30]。暴露于X射线辐射后，肿瘤细胞能释放出调节免疫应答激活的另一个关键因素，即高迁移率族蛋白B1[31]。另外辐射还能激活环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-STING途径来触发免疫反应[32]，总之，辐射起着增强抗原呈递细胞清除受损肿瘤细胞的作用，从而促进了T细胞的启动。辐射引起的DNA损伤可能会产生新抗原并触发免疫监视，RT增强了细胞毒性免疫细胞的炎性免疫反应和肿瘤内浸润，而ICB可以克服CD8（+）T细胞中辐射诱导的耗竭，并恢复其抗肿瘤免疫反应。

研究证实了各种HCC细胞系照射后PD-L1的表达呈剂量依赖性上调，这主要是通过IFN-γ-STAT3信号通路介导的[18]。同样，临床研究也报道了CD8（+）T细胞和肿瘤细胞分别在RT后PD-1和PD-L1表达的上调[33]。这些研究为RT与ICB的结合提供了合理的依据，并被视为HCC治疗成功的关键策略。临床前数据表明，RT与ICB的结合表现出协同治疗作用并有着出色的肿瘤控制率。在用单次10Gy RT和抗PD-L1治疗的HCC小鼠中观察到了显著的肿瘤生长受抑制和OS的改善[18]。与单一疗法相比，在乳腺癌小鼠异种移植模型中同时进行抗PD-L1和12Gy的RT发挥了较好的肿瘤控制作用[16]。在分次放疗（2Gy×5）和抗PD-1联合治疗的CT26鼠结肠癌异种移植瘤模型中也观察到了类似的现象。RT和抗CTLA-4之间的协同作用也已在几种鼠类肿瘤模型中得到证实。更重要的是，正如依赖于CD8（+）T细胞的肿瘤免疫再激发排斥反应所显示的那样，这些效应是持久的。尽管有令人鼓舞的临床前发现，但我们尚无关于肝癌放疗和ICB联合治疗的公开发表的前瞻性临床数据。Chiang等报道了5例不可切除的大型HCC的患者中，进行了SBRT后续使用nivolumab免疫治疗有着100%的ORR[34]。评估ipilimumab治疗肝/肺SBRT的I期临床试验报告显示，有23%的患者取得了临床获益，且和外周血CD8（+）T细胞数目以及CD8（+）/CD4（+）的比例增加有关[35]。目前正在进行其他一些前瞻性临床试验，以评估RT和HCC免疫疗法的结合方法。该领域尚处于初期阶段，其中大多数研究表明，在接受RT和ICB联合治疗的患者中，其疗效和可耐受的毒性特征是令人乐观的，但并未指定最佳的RT剂量、分割方案和RT/ICB治疗顺序。这些治疗模式的确定主要取决于肿瘤类型和突变负荷[36]。此外，大剂量少分割比常规分割放疗更受青睐，使用8-10Gy剂量的放疗来似乎能更好地诱发抗肿瘤远位效应[37]。

五、联合治疗的未来展望

研究显示在RT之前使用抗血管生成剂，这可以使肿瘤脉管系统“正常化”，从而可能有更好的放疗疗效[38]。联合治疗后可给予ICB，以进一步维持抗肿瘤免疫力。除了目前在HCC中已被广泛评估的免疫检查点抑制剂外，亦有其他新型靶标如吲哚胺 2，3 双加氧酶（Indoleamine-2，3-Dioxygenase，IDO）。IDO是一种参与免疫稳态的酶，可以使肿瘤细胞逃避免疫监视。IDO在HCC肿瘤中的过表达与预后不良有关，树突状细胞通过IDO抑制T细胞并促进HCC的进展[39]。用Lewis小鼠模型进行的临床前研究表明，用IDO抑制剂和RT进行治疗可协同降低Treg以及下调树突状细胞和T细胞表达PD-1、PD-L1和TIM-3等免疫抑制因子[40]。亦有一些研究显示IDO也具有抗肿瘤特性，因此IDO与RT联合治疗HCC的潜力尚待确定。目前，其他几种B7家族配体，例如B7-H2和B7-H3在其他肿瘤类型被用作的新型免疫治疗靶标，在HCC中，B7-H2和B7-H3的独立或联合表达都与患者的复发和较差的生存率相关[41]，其在未来可能成为治疗HCC有希望的联合剂。嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptors-modified T，CAR-T）细胞疗法在淋巴瘤患者和具有可被用作特异性靶标基因驱动突变的实体瘤中显示出良好疗效[42]。然而，HCC是一种在转录组上异质性很大的实体瘤，以磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（Glypican-3，GPC3）为例，其在成人肝脏不表达, 于肝癌发生时常常再激活。它参与细胞分裂和生长的调控，与HCC的不良预后有关[43]。一项最近结束的I期临床试验的结果对GPC3 CAR-T细胞疗法在HCC患者中的安全性进行了调查，结果表明该药具有良好的耐受性并显示出抗肿瘤活性作用。对于实体瘤，CAR-T细胞疗法的安全性和有效性是令人乐观的，并且作为未来恶性肿瘤新型免疫疗法，其发展前景令人期待[44]。另外，外周免疫表型可作为SBRT以及SBRT和ICB联合治疗的疗效预测。放射敏感性指数和放射敏感性基因的使用也已被大量研究，但它们的使用价值却有限[45]。考虑到RT治疗后周围脉管的放射敏感性、毒性和免疫原性特征，优化联合RT和ICB的方案亦值得进一步探讨。因此，需要进一步研究在放疗后TME中关键免疫检查点分子的变化，通过研究这些分子的改变及其在后续肿瘤免疫中的作用，以确定需要使用的ICB类型和RT联合ICB治疗剂量和顺序。总而言之，目前对于肝癌的各种治疗缺乏可靠的预测性生物标志物，这表明在该领域需要投入更大的努力，以便更准确地选择对患者提供最大临床获益和最小副作用的治疗方法。

六、总结

肝癌微环境中免疫抑制作用已被能促进肿瘤发生并被耗竭的免疫细胞所证明，这使ICB成为肝癌患者充满希望的治疗选择。在过去的20年中，放疗技术的进步提高了HCC中RT的疗效。通过联合治疗，ICB可以克服RT诱导的免疫检查点分子/通路的上调并恢复抗肿瘤免疫力。反过来，RT还可以将原本“冷”的TME重塑为具有免疫反应性的“热”TME，从而协同提高ICB的有效性。除RT和ICB之外，还可以探索抗血管生成剂的联用，其可促进肿瘤血管的正常化并诱发TME中的局部免疫效应。近年来，可供联合免疫治疗选择的种类迅速增加，因此需要发现更多的预测性生物标志物，以便确定最合适的治疗策略并取得最佳的临床获益。