急性呼吸窘迫综合征中的凝血异常及治疗的研究进展

张 鹏综述，聂时南审校

0 引 言

新型冠状病毒(coronavirus virus disesse,COVID-19)诱发急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是患者最终死亡的重要原因之一。ARDS是休克、创伤、肺内感染等非心源性疾病引起的肺实质弥漫性炎症损害，早期先天免疫细胞介导肺毛细血管内皮细胞和肺上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，甚至器官功能障碍，影像学以急性发展的双肺毛玻璃改变为特征，表现为顽固性急性低氧性呼吸功能不全或者衰竭[1]。目前认为ARDS与脓毒血症发病机制相似，基本病理变化是机体内促炎-抗炎自稳态失衡所致、伴有免疫防御功能下降以及失控的炎症反应，其变化包括内皮损伤、凝血功能早期增强，纤溶系统广泛抑制和纤维增生，最终造成肺实质广泛弥漫性损伤。自从ARDS第一次被Murray等定义后，针对ARDS的病理生理机制经过长时间的研究逐步建立多种动物模型[2]。由于凝血与纤溶在ARDS病理机制发挥重要作用，已经成为潜在的治疗位点。本文主要针对ARDS病程中的凝血及纤溶途径及治疗作一综述。

1 凝血级联反应异常

组织因子(tissue factor,TF)是一种表达于脑、肺和肾等多个器官血管外膜的成纤维细胞中单链糖蛋白，同时也分布于上皮细胞、血小板和微粒中，在凝血级联反应中起重要作用。正常情况下除血管外层平滑肌细胞、成纤维细胞可恒定表达少量TF外，与血浆直接接触的中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞及单核细胞中无TF表达。脓毒血症或多功能器官损伤导致ARDS的情况下，平常因为保护宿主细胞而表现为低活性状态的TF由于内皮细胞损伤而激活，释放到血流中，随后与凝血级联的蛋白酶相互作用，从而激活整个凝血过程[3]。

TF在Ca2+的作用下通过与凝血因子Ⅶa在细胞表面结合而被激活形成TF-FⅦa复合物，然后TF-FⅦa复合物催化FⅨa形成及与FⅤa一同催化Fⅹa形成，形成凝血酶原酶复合物，然后催化为凝血酶激活凝血级联反应。对ARDS的病情发展而言，受到IL-6、C反应蛋白、TNF-β及其他炎症介质刺激不断上调表达TF，是ARDS早期血液高凝状态的主要环节。以往研究认为抑制TF活性可改善血液高凝状态、减轻内毒素引起的肺损伤及促炎因子的释放。但而后发现TF介导的凝血酶募集血小板和催化纤维蛋白早期形成微血栓，微血栓形成阻止病原体入侵，形成早期的屏障作用减少毒物及病原体对肺组织的损伤。微血栓形成造成的先天免疫细胞聚集并激活扩大炎症反应的同时也进一步刺激TF的表达。Shaver等[4]发现肺泡上皮受损是ARDS发病时TF的主要来源。发病期间TF的激活具有肺保护作用，通过凝血激活免疫微血栓形成与纤维蛋白早期沉积等屏障作用减少肺泡-毛细血管膜渗漏。Bastarache等[5]证明，在通过敲除TF基因的小鼠建立ARDS模型中，整体缺乏的TF降低肺保护作用，实际上总体的TF缺乏增强了肺损伤的部分生物学指标。现有研究表明上调表达TF是ARDS早期诊断的重要支持因素，TF也是脓毒血症相关ARDS的独立死亡因素[6]。早期识别及干预TF有利于轻度ARDS患者的预后，改善内皮渗透性及高凝凝血状态，预防可能出现的弥散性血管内凝血。

在急性肺损伤中，TF的基因表达强度是可被包括TNF-α、IL-1β等细胞因子诱导增强的，而LPS和大部分细胞因子往往是通过顺式介导包括激活蛋白-1启动子区域式作用调节元件(AP-1)、特异性蛋白1(SP-1)和核因子κB(NF-κB)位点等达到TF基因高度表达的目的。最近的研究中，NF-κB-p65基因在LPS诱导ARDS的高凝及纤溶抑制密切相关， Wu等[7]研究中通过NF-κB的可渗透抑制剂SN50抑制NF-κB通路，降低p’-p65的表达及p65DNA的活性，抑制TF、PA抑制剂(plasmin-activator inhibitor type 1,PAI-1)等表达减轻肺水肿及渗出，减少肺组织损伤。通过其他通路同样可调节TF表达，Kurakula等[8]发现肽基脯氨酸异构酶Pin1增强激活血管内TF基因表达，并通过TF基因的胞质域中的pser258-Pro259母体直接与TF蛋白结合，调控增强TF蛋白活性及血管内凝血活性。Pin1可成为TF蛋白活性的上游作用位点同时Pin1抑制剂也可能成为抑制TF活性的有效药物之一。也为ARDS的凝血障碍提供潜在作用位点。TF基因表达同时也存在复杂的翻译后修饰而调节其促凝血活性。在细胞表面TF的活性调节被称为加密/解密。而加密/解密可能通过改变膜微环境的功能从而调节TF活性。当加密状态下TF蛋白仍可结合FⅦ，但只是作为一个细胞因子受体发挥发送胞内信号作用，并不能激活FⅩ而激活凝血级联反应。

研究表明凝血与炎症之间的串扰成为新的热点之一。蛋白酶激活受体(protease-activated receptor,PAR)在TF介导的凝血级联反应发挥重要作用。PARs蛋白是G蛋白偶联相关受体的一个亚家族。其中PAR-1、PAR-3和PAR-4可被凝血酶激活。凝血酶低水平表达时PAR-1表现为肺保护作用，高水平表达时PAR-1的激活可能对内皮屏障产生破坏[9]。Jenkins等[10]发现在高通量通气的小鼠模型中气管内灌注PAR-1激动肽加重肺水肿的程度，证明PAR-1通过αvβ6介导TNF-β活性调控肺水肿的发展。虽然TF可激活PAR-1和PAR-2的活性，但是TF-FⅦa复合物只可通过激活PAR-2提高粘附因子表达增加炎症反应。Pawlinski等[11]通过遗传及药理学分析小鼠内毒素血症模型中组织因子和蛋白酶激活受体在凝血和炎症中的作用。发现与对照小鼠相比，低TF因子小鼠的凝血、炎症和死亡率均呈现下降趋势。同样，由于缺乏TF表达的造血细胞，也造成脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的凝血、炎症和死亡率的降低。单独的蛋白酶激活受体1(PAR-1)或PAR-2的缺乏均不会影响炎症或存活。但是，凝血酶抑制和PAR-2缺乏症的结合降低了炎症和死亡率。这些数据表明多种蛋白酶激活的受体介导了凝血和炎症之间的串扰。但是，凝血酶抑制和PAR-2缺乏症的结合降低了炎症和死亡率。这也同时说明，结合抗凝剂抑制PAR依赖性信号传导可能是治疗ARDS的有效策略。除此以外TF因子也在诱导新生血管形成和冠状动脉斑块破裂中发挥着重要作用[12]。

2 拮抗凝血异常

2.1组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI) TFPI是血液内皮细胞合成的TF内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂，ARDS的血液高凝状态的同时TFPI与TF-FⅦa复合物结合抑制FⅩ的活化，从而阻止凝血级联反应的进展和纤维蛋白的沉积。早期在一项回顾性研究中，与对照组相比ARDS组患者支气管肺泡灌洗液中TFPI明显升高。从而TFPI成为临床ALI/ARDS中TF介导的外源性凝血反应的潜在的研究方向。尤其是在随后的动物实验中，给予重组TFPI的实验组兔子得到器官功能的改善及死亡率的降低实验结果。然而在人类研究中发现，组织因子途径抑制剂α蛋白链C末端与FⅤ的B结构域结合，通过阻止FⅤ在Arg1545处的裂解抑制FⅤ活化从而起到抗凝的效果[13]。Peter等[14]发现血浆中FⅤ包含两种分别具有低和高磷脂结合亲和力的糖基化同工型(FⅤ1和FⅤ2)，其中FⅤ2更有利于TFPI抗凝作用的发挥。之前的研究认为TF与TFPI之间的失衡是ARDS凝血功能及纤溶功能异常的重要影响因素。尽管体内存在高水平的内源性TFPI，但TF介导的外源性凝血活性可能出现未受其影响仍表现为高凝血活性的情况，考虑可能存在其他机制致使大部分内源性TFPI处于非活性状态。

然而TFPI的作用及TFPI与TF平衡对ARDS患者的研究至今仍未有令人信服的证据。重组TFPI的Ⅲ期临床试验中虽然证明凝血酶活性的标志物有大幅度下降，但未能如期降低严重脓毒血症诱发ARDS患者的死亡率[15]。但在最近一项急性肺损伤小鼠模型的研究结果中，人组织因子抑制剂(human tissue factor pathway inhibitor,hTFPI)的表达与炎症显著减少有关，并在LPS诱导的急性肺损伤模型中提高存活率。hTFPI的表达通过抑制白细胞浸润而抑制肺损伤的发展，这与趋化因子CCL2的表达密切相关。这也为ARDS患者的治疗提出了新的策略[16]。

2.2活化蛋白C(activatedproteinC,APC)与蛋白C途径蛋白C是由肝合成的维生素K依赖性糖蛋白，是内源性抗凝剂重要的组成之一。在内皮细胞表面，蛋白C由凝血酶-血栓调节素复合物激活裂解为APC。APC抑制FⅤa和FⅧa从而减少凝血酶生成并降解中心粒细胞的组蛋白，在APC抗凝的同时防止中性粒细胞激活及抑制白细胞的粘附和滚动来发挥抗炎活性[17]。而APC的合成及表达受到血栓调节蛋白(thrombomoduline,TM)和内皮细胞蛋白C受体的调控。同时APC也中和PAI-1促进纤溶、减少纤维蛋白的合成及沉积。由于凝血酶与PAR-1、PAR-3和PAR-4的激活相关，而且Fⅹa和PAR-2的激活相关，因此APC通过对凝血酶的抑制从而同时具有抗凝与抗炎两种活性。蛋白C途径是ARDS中凝血和纤溶蛋白重要的内源性调节途径。

在一项蛋白C与TM在ALI的作用研究中，脓毒症导致的ARDS患者的肺泡水肿液中TM的含量比正常血浆高10倍，比非脓毒症致ARDS患者高2倍，而蛋白C水平则明显低于正常。研究证明低水平含量蛋白C与较差临床结局相关，而血浆中可溶性TM水平上升与ARDS的死亡率增加有关[18]。蛋白C抗凝及抗炎的效果使之成为潜在治疗位点。在Cornet等[19]的一项多中心随机对照试验中，静脉输注重组APC组的患者的肺损伤评分第5天得到明显降低，改善肺功能。这些均证明APC在ARDS病程中扮演着越来越重要的角色。对于严重败血症致ARDS患者，重组APC可能是治疗的可行选项之一。但是在随后的PROWESS-Shock试验中呈现阴性结果。在这项随机、双盲、安慰剂对照的多中心试验中，随机分配了1697例感染、全身性炎症和休克的患者，结论却是对于感染性休克患者，试验组与安慰剂组在28 d和90 d时的死亡率无显着差异[20]。在一项重组APC联合小剂量类固醇激素治疗脓毒血症的随机对照试验中，仍然无法证明重组APC可有效降低死亡率[21]。以及一项静脉输注重组APC的随机对照试验仍无法证明4 d内其对ARDS预后存在有效改善[22]。加上重组APC从市场上撤出的原因，很多假设无法验证。Liu等[23]研究通过敲低Ⅱ型肺上皮细胞NF-κB-p65基因提高APC含量改善LPS刺激造成的凝血及纤溶异常，这可能APC研究的潜在方向之一。

2.3蛋白S途径蛋白S作为APC的辅助因子可辅助调节FⅤa、FⅦa发挥抗凝作用，进而同时抑制凝血酶生成抑制炎症反应。蛋白S也可作为组织因子途径抑制剂α的辅因子激活对Fⅹa的抑制，同时蛋白S也独立具有非APC依赖性抗凝活性，这项功能可能与Tenase复合体以及结构中含锌蛋白密切相关。蛋白S在机体内不仅表达抗凝活性，也表达出免疫活性。蛋白S通过结合补体调节蛋白C4b(C4BP)在表达抗凝活性同时也调节免疫活性，又通过结合和激活TAM受体调节免疫细胞活性和血管内皮完整性。在Takagi等[24]制作的LPS诱导ALI小鼠模型中，提示蛋白S在不影响凝血的前提下同时却可调节炎症水平。蛋白S所具有的抗凝、免疫调节、抗炎、抗凋亡等作用在ARDS病程中起着积极肺保护作用。Baffour等[25]研究发现，LPS诱导的ALI小鼠模型中人类蛋白S转基因小鼠的炎症因子等炎症指标较野生小鼠降低明显，证明人蛋白S对LPS诱导的ARDS具有保护作用，同时证实蛋白S的肺保护功能与抑制细胞凋亡密切相关。因此，调控凋亡可能是ARDS治疗的重要途径。

2.4肝素肝素是体内肥大细胞及血液中的嗜碱性粒细胞和内皮细胞生成的一种天然抗凝剂。肝素可通过与凝血酶结合以改变其结构达到抗凝效果和对凝血酶系统的几种丝氨酸蛋白酶(主要是FⅡa、FⅩ、FⅨ)的抑制达到抗凝作用。Tuinman等[26]发现雾化的抗凝剂具有减轻肺部凝血病的潜力，发现雾化的肝素可改善吸入烟雾诱导的ALI患者的生存率。在一项机械通气超过2天的重症患者的临床试验中，雾化的肝素的运用与机械通气天数更少有关。与临床前研究的结果一致，同时发现肝素雾化虽然可影响全身性凝血，但不会引起全身性出血。肝素同时也具有抗炎效果。Camprubi-Rimblas等[27]研究表明，肝素可通过抑制巨噬细胞促炎性细胞因子的表达从而减少肺泡巨噬细胞浸润，抑制肺泡细胞中的NF-κB径来显着改善LPS诱导的肺损伤。也证实可通过雾化对肝素进行局部肺部给药减轻肺部炎症。雾化肝素的运用对改善ARDS预后是起积极作用的。在COVID-19相关ARDS的治疗中，预防性肝素抗凝治疗有助于降低患者的炎症状态[3]。

最新的研究指出普通肝素(unfractionated heparin,UFH)治疗通过减少BALF的IL-6并保护肺微血管内皮细胞中的紧密连接(tight junction,TJ)减轻了肺损伤。UFH还可保护TJ免受脂多糖刺激的损伤，并通过抑制ERK1 / 2 MAPK途径减弱内皮的高通透性并下调TJ蛋白(如claudin-5和ZO-1)在上游起作用[28]。这些发现表明，UFH具有治疗脓毒症引起的ARDS或ALI的潜力，但是还需要更多的实验和数据去验证肝素的肺保护作用；同时肝素的肺保护作用可能并没有期望中效果显著。Abdelaal等[29]比较了雾化型纤溶酶原激活剂、链激酶和雾化肝素治疗ARDS的疗效，发现链激素组第1天到第8 天氧合指数明显优于其他组而且链激素组ICU的死亡率也得到显著降低。

3 纤溶系统异常

ARDS的纤维蛋白沉积是其临床综合征的标志，纤维蛋白沉积的多少与ARDS的临床结局密切相关。肺内凝血增强通常也会导致内源性纤维蛋白的降解失衡，继而致使纤维蛋白大量沉积。而纤溶酶受到纤溶酶原(plasminogen activator,PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-plasminogen activator,uPA)、组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1、PAI-2)等调控。尽管uPA与tPA两者均可激活纤溶酶原，但uPA作为一种细胞表面蛋白可导致组织水平的纤维蛋白溶解，而uPA必须与uPA受体(uPAR)结合才能发挥作用。tPA与纤维蛋白结合才能在血管内产生溶栓作用。在较近的研究中发现，ARDS病程中C反应蛋白促进内皮细胞局部释放PAI-1，PAI-1水平的升高抑制BALF中uPA和tPA的活性，纤溶酶原激活系统的减弱导致肺泡腔纤维蛋白的异常转换。一项多中心回顾性临床研究证明PAI-1的升高是早期肺损伤/ARDS的死亡和不良临床后果的独立影响因素之一[30]。PAI-1作为ARDS预后标志物的作用已被一项前瞻性观察研究证实。而一项Meta分析表明多种动物模型中通过使用tPA、uPA和纤溶酶，与对照组相比BALF中PAI-1及中性粒细胞明显降低，有效改善肺功能并减轻炎症反应，死亡率也显著降低[31]。在COVID-19相关ARDS的治疗中tPA的使用可在时间上缓解患者的呼吸状态，延缓病情进展[32]。这些都表现出纤溶系统在ARDS患者预后中的潜在能力。

较前的研究中发现肺上皮细胞调节uPA-uPAR-PAI-1纤溶系统的途径，包括通过uPA信号调节、uPA诱导的介体表达及uPA和p56之间的串扰。而uPA也同样可通过其调节肺上皮细胞的生存，尤其是uPA以双相浓度依赖的方式调节肺上皮的蛋白p53，并且p53表达的变化影响上皮细胞凋亡或存活，从而直接影响ALI/ARDS的严重程度。同时p53通过一种反馈机制调节肺上皮细胞uPA、uPAR和PAI-1的表达，通过这些复杂的机制相互作用肺上皮细胞调节ALI/ARDS的局部纤维蛋白溶解及细胞活力、炎症和纤维蛋白的异常更新[33]。通过p53调节uPA-uPAR-PAI-1纤溶系统可能成为治疗ARDS的手段之一。Bhandary等[34]在小鼠肺损伤模型中证明存在于uPA、uPAR、PAI-1与p53表达之间的相互作用，同时证明caveolin-1支架结构域肽对于该途径的抑制以及对于博来霉素诱导的肺损伤的保护作用。在最近的研究中发现IKKβ基因可通过NF-κB-p65信号通路调节LPS刺激的肺泡Ⅱ型上皮细胞中凝血和纤溶因子的表达和分泌。IKKβ途径可能成为预防及治疗ARDS的新标靶[35]。而在COVID-19相关的ARDS患者中，低分子量肝素可限制ARDS中凝血病的发展，但无法降解已形成的肺内纤维蛋白，雾化tPA的使用可有效促进危重患者的纤维蛋白降解并改善氧合[36]。

4 结 语

ARDS的病程中凝血与纤溶功能严重失衡，继而致使肺泡腔内纤维蛋白大量沉积。这一切的发生与炎症激活的凝血级联反应形成大量微血栓一起可在一定程度上缓解病情发展。但随着TF的过度表达激活PAR受体等多条炎症途径使炎症反应逐步增强，同时失衡的TFPI与降低的蛋白C途径也加速炎症反应的放大以及纤溶过程通过p53途径互相作用干涉炎症反应。ARDS继发的瀑布性全身炎症与凝血反应、纤溶蛋白溶解过程紧密联系。相关研究虽然在动物实验取得较好的成果，但临床实验一直不太理想。未来ARDS的凝血异常的治疗的研究可能着眼于抗凝药物的雾化吸入治疗及联合运用上。而对于纤维蛋白沉积与炎症相关途径的研究可能会成为预防与治疗ARDS的一个新方向，值得进一步研究。