基于PdAu纳米颗粒的非标记型凝血酶传感器的研制

2014-09-02冯亚娟等

分析化学 2014年8期

冯亚娟等

摘要采用电沉积方法将Pd纳米颗粒沉积到玻碳电极（GCE）表面，再将Pd纳米颗粒修饰电极插入H2SO4溶液中，吸收适量活性氢后，转移到HAuCl4溶液中，静置一定时间后，使金被活性氢还原并自发沉积到Pd 纳米颗粒修饰的玻碳电极表面。通过自组装作用将带巯基的凝血酶适配体Ⅰ固定在PdAu/GCE表面，制得非标记型凝血酶适配体传感器。当凝血酶与凝血酶适配体结合时，覆盖在电极表面，从而阻碍了电极表面的PdAu纳米颗粒对H2O2的催化还原活性，通过监测H2O2还原电流的减小程度，实现对凝血酶的定量检测。考察了pH值、培育时间等实验条件对响应电流的影响以及PdAu纳米颗粒的协同作用。

1引言

适配体是由指数富集的配基系统进化技术（SELEX）＼[1＼]所筛选得到的功能性寡核苷酸短片段，这些短核苷酸片段可用于灵敏、专一地检测能与其有特异性结合的分子，如金属离子、有机小分子化合物、代谢物和蛋白质等＼[2，3＼]。与抗体相比，适配体具有明显优点，如保存容易、重现性好、容易修饰和方便再生等＼[4～6＼]。

凝血酶＼[7＼]是人体血液中一种重要的丝氨酸蛋白质，在止血的生理和病理过程中起关键作用的蛋白水解酶。其在脑出血后的病理生理学过程中起重要作用，抑制凝血酶的活性对治疗脑出血有重要的临床意义＼[8，9＼]。因而检测凝血酶对治疗人体疾病具有重要价值。基于电化学生物传感器检测凝血酶被广泛报道。Wang等＼[10＼]报道了一种标记型的电化学适配体传感器用来检测凝血酶，主要是用凝血酶的两段适配体与目标物的特异性结合而形成“三明治”结构，在其工作中，适配体I被FcSH/SiNCs标记，适配体Ⅱ被固定在被链霉亲和素修饰的磁珠一端。当凝血酶出现时，适配体Ⅰ和适配体Ⅱ与凝血酶特异性结合形成一种的特殊的夹心结构。其检测线性范围是0.1～5.0 nmol/L，检出限为0.06 nmol/L。Huang等＼[11＼]研制了一种基于量子点标记的电化学发光传感器用来检测凝血酶，在其检测中，凝血酶适配体Ⅰ被固定在金电极上，适配体Ⅱ被量子点标记，由于两段适配体与同一个目标物均有特异性结合，很容易形成“三明治”结构，通过其结合后适配体构型改变来检测凝血酶的浓度。线性范围是0～20 mg/L。Wang等[12]研制了一种将适配体固定在氧化石墨烯（GO）表面的电化学免疫适配体传感器。通过物理吸附GO固定在玻碳电极或金电极表面，因氨基化的适配体与氧化石墨烯表面的COOH之间的化学键作用将适配体固定在石墨烯修饰电极的表面。将功能化的适配体分为两段互补的一段通过内嵌的方式包裹着Ru（phen）2+3，并作为探针。当无凝血酶时，Ru（phen）2+3在电极表面传感器有高的电信号；而加入凝血酶后，适配体与凝血酶特异性结合，Ru（phen）2+3被释放电化学信号减弱，并以此在确定凝血酶的浓度，该传感器的线性范围是0.9 pmol/L～226 nmol/L。Yi等[13]研制了一种以核酸外切酶催化回收目标物和酶催化的电化学适配体传感器用于凝血酶的测定。在3巯丙基三甲氧基硅烷的表面大量的植入乙醇脱氢酶（ADH）后呈现出可变的多孔结构，再将金纳米颗粒固定在其表面用于催化NADH，为了提高电化学响应信号，在daDNA的一端标记亚甲基蓝。当凝血酶和Recjf的混合物出现时，凝血酶的适配体 Ⅰ和适配体 Ⅱ 特异性结合，此时核酸外切酶将凝血酶适配体Ⅱ从5′→3′方向降解，释放凝血酶进入溶液中，游离的凝血酶与适配体Ⅱ结合完成目标物的回收和电化学信号的放大，该传感器的线性范围是5 pmol/L～100 nmol/L。然而，标记型电化学适配体传感器必须经过一个复杂的修饰过程，是标记过程复杂且成本高。Du等＼[14＼]研制了一种基于负载二茂铁的聚乙烯亚胺、DNA适配体以及碳纳米管层层自组装多层膜的无标记型凝血酶适配体传感器。该传感器的线性范围为0.3～165 μg/L，检出限为0.14 μg/L。

本研究制备一种非标记型电化学适配体传感器，用于灵敏快速地检测凝血酶。首先在玻碳电极表面采用电化学方法沉积PdAu纳米颗粒，然后通过AuSH之间强力的键合作用，将凝血酶适配体Ⅰ固定在其表面；当凝血酶与凝血酶适配体结合时，覆盖在电极表面，从而阻碍了电极表面的PdAu纳米颗粒对H2O2的催化还原活性，通过监测H2O2还原电流的减小程度，实现对凝血酶的定量检测。

3结果与讨论

3.1PdAu纳米颗粒的微观形貌

采用SEM观察PdAu 纳米颗粒的微观形貌（图2），颗粒整齐地分散在GCE表面，平均粒径约100 nm。微纳米颗粒的催化作用跟其表面积大小有关。一般来说，纳米颗粒的催化反应是表面反应，反应主要与催化剂的表面积和活性中心有关[16]。颗粒半径越小表面能越大，整体比表面积越大，催化效果越高。另外，当粒子的大小在1～10 nm时，就会出现量子效应，成为量子化粒子，导致明显禁带变宽，从而使电子空穴对具有更强的氧化还原能力，催化活性将随尺寸量子化程度的提高而增加。尺寸的量子化也使半导体获得更大的电荷迁移速率，空穴与电子复合的几率大大减小，也有利于提高催化反应的效率。但同时大表面积也就意味着表面上出现复合中心的机会也越多，当复合起主要作用时，也会出现活性随量子化程度的提高而下降的情况。对于H2O2的催化随着粒径的增大而减小。

3.3传感器的电化学阻抗行为

电化学阻抗是检测电极表面修饰状态的常用工具，图5为此传感器制备过程各阶段修饰电极在TrisHCl溶液中的交流阻抗图。曲线a为裸GC电极的阻抗图，近似一条直线，表明电子传递到电极表面只受扩散控制。曲线b为Pd NPs/GC电极的阻抗图，出现了较高的阻抗值Ret=450 kΩ。曲线c为PdAu NPs/GC电极的阻抗曲线，阻抗值Ret=400 kΩ，主要是由于当金纳米颗粒修饰到电极上时，电极表面金属纳米颗粒的数量增加同时也就增加了电极表面与溶液之间电子的传递；曲线d分别为Thrombin aptamer Ⅰ/PdAu NPs复合膜修饰后的电极的阻抗曲线， Ret=800 kΩ，这是因为修饰上适配体后电极表面形成了一层绝缘层。曲线e为Thrombin aptamerⅠ/PdAu NPs修饰后的电极结合目标物凝血酶后的阻抗图，

阻抗值剧增至Ret=1800 kΩ。这是由于绝缘的蛋白质分子凝血酶与电极表面的适配体结合形成了体积较大的复合物，阻碍了电子传递，表明凝血酶已与电极上凝血酶适配体Ⅰ结合。

3.8回收率的测定

为考察此传感器的实用性，本实验在稀释10倍的人体血清样品中进行了凝血酶的回收率的测定，结果见表1。平均回收率为98.5%，说明此传感器能用于凝血酶的测定。

4结论

应用电化学沉积的方法将PdAu纳米颗粒修饰在玻碳电极表面，再将凝血酶适配体Ⅰ固定在其表面，构建了一种新型非标记型适配体传感器。当凝血酶与适配体结合时，覆盖在 PdAu表面。阻碍其催化H2O2的还原反应。因此，H2O2的还原电流随着凝血酶浓度的增大而减小，可实现对凝血酶的检测。

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AbstractPd nanoparticles （Pd NPs） were electrodeposited on the glassy carbon electrode （GCE）. Then， Pd NPs/GCE was further inserted into H2SO4 solution to polarize for 5 min to absorb a certain amount of active hydrogen. Then， the electrode was quickly inserted to HAuCl4 solution for 15 min. AuNPs were deposited spontaneously on the surface of Pd NPs due to the reduction of active hydrogen. As a result， PdAuNPs were modified on the surface of GCE. Next， aptamer I of thrombin was immobilized on PdAu nanoparticles. In the presence of thrombin， it bound with the aptamer immobilized on PdAu nanoparticles and thus the formed complex obstructed the catalysis of PdAu nanoparticles to H2O2. Hence， the reduction current of H2O2 decreased with the increase of thrombin concentration. The aptamer sensor had a good linear relationship with the concentration of thrombin in the range of 2.98-297 nmol/L with a detection limit of 0.98 nmol/L.

KeywordsLabelfree； Aptasensor； Thrombin； Palladiumgold nanoparticles