肿瘤耐药的细胞可塑性机制及启示

李 玲

(空军军医大学国家分子医学转化中心，陕西 西安 710032)

1 肿瘤细胞耐药性的非遗传适应性机制

近20年，随着小分子靶向药物和免疫检查点抑制剂在临床实践中的相继应用，癌症患者的生存预后得到了极大改善。然而，与传统化疗药物或放射治疗类似，这些药物只对少部分患者有效，对大多数患者尤其是进展期或已有转移灶的患者而言，疗效并不理想，往往出现对药物的抵抗性，甚至复发、转移。因而，肿瘤细胞对治疗药物的抵抗性即肿瘤细胞的耐药性一直是临床中亟待解决的难题。

长久以来，人们认为肿瘤细胞耐药性的根源在于基因的遗传进化(genetic evolution)，即肿瘤细胞通过产生基因突变、扩增、缺失或染色体易位等改变，导致靶蛋白突变无法结合药物、激活信号转导通路下游效应分子或替代生存信号，进而逃逸放化疗、靶向治疗或免疫治疗的杀伤作用并继续存活增殖[1-2]。上述基因改变可能原先就存在于少数肿瘤细胞比如肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)中，成为引起先天性耐药的根源；也可能在接受药物治疗的过程中后天产生，进而导致获得性耐药[1]。与此相对应，基于测序技术的肿瘤基因组学数据不断积累，一方面为肿瘤治疗靶标筛选和临床结果预测提供新思路，同时也导致个体化/精准医学的兴起。然而，常规测序技术由于测序深度的限制，只能检测到肿瘤细胞群体中的显性突变克隆，新近高分辨率单细胞测序的结果表明，在癌症克隆进化中出现的所有突变细胞克隆在癌症起始阶段可能就存在，只是程度不同[2]，提示基因的遗传进化并非唯一或事实上最常见的治疗性抵抗机制。面对治疗药物的应激压力，肿瘤细胞可能通过非基因改变的方式，通过细胞的适应性改变，产生治疗耐受性或抵抗性；前者指肿瘤细胞暂时存活下来并维持在增殖静止状态成为慢周期细胞(slow-cycling cells)，临床上称为微小残余病灶(minimal residual disease,MRD)；后者指肿瘤细胞不仅存活下来并可在药物存在的条件下进入增殖状态。目前认为，这种非遗传的适应性(non-genetic adaptive)改变，可能是肿瘤细胞耐药性具有普遍性的共性机制，已成为近年来肿瘤耐药性研究的新热点和新挑战。

从概念上讲，适应性反应(adaptive response)是指肿瘤细胞在对抗药物压力并生存增殖时，通过基因表达和表观遗传学的改变，将自身塑造成更加耐受或抵抗治疗的状态或表型的现象。通常，这一反应是暂时、可逆的，获得的特征不能稳定地遗传给子代细胞。肿瘤细胞耐药性的非遗传适应性机制主要涉及肿瘤细胞本身的适应性改变如细胞状态或表型可塑性，以及肿瘤微环境的适应性改变。后者是指药物直接、或通过诱导肿瘤细胞分泌细胞因子间接影响微环境中的间质或免疫细胞(如巨噬细胞)，进而影响肿瘤细胞对治疗药物的抵抗性[3-4]。本文将重点探讨肿瘤细胞本身的适应性改变，即药物诱导的细胞可塑性。

2 药物诱导的细胞可塑性现象

在抗癌药物压力下，肿瘤细胞具有的进行适应性状态或表型转换的能力称细胞可塑性(cell plasticity)[1,5]。肿瘤细胞的可塑性特性使其能够在面对药物杀伤作用时转化为耐受或抵抗的细胞状态或表型，因而不再依赖原先的药物靶点与通路，得以逃逸药物的攻击。2011年，Sequist，等[6]找到了细胞可塑性介导药物治疗抵抗性的首个临床证据，作者发现少数非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制剂的治疗表现为抵抗，相应的患者肿瘤组织类型转化成为了小细胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)，停药后，患者又恢复了对EGFR抑制剂的敏感性。药物诱导肿瘤细胞可塑性的最常见现象是上皮细胞-间充质细胞转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)。此外，谱系转分化、增殖-侵袭表型转换亦是细胞可塑性的表现。

EMT一直被认为是肿瘤侵袭转移过程中的关键步骤，然而新近研究发现，其与肿瘤细胞的耐药性关系更为密切，并且EMT相关的耐药性可能先于EMT引起的侵袭转移。例如，EGFR抑制剂获得性耐药的肺癌患者活检组织标本中，间质细胞标志分子波形蛋白(Vimentin)表达增加，上皮细胞标志分子上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)表达缺失[1]，采用表观遗传修饰药物JMF3086诱导EMT，肺癌细胞出现对EGFR抑制剂的耐药性[7]。尽管EMT促进肿瘤细胞耐药性的机制目前尚不明确，但现有研究均证实EMT是肿瘤细胞获得耐药性的重要原因，这也充分证明了细胞表型转换对于肿瘤细胞耐药性的关键作用。

谱系转分化是指不需经历祖细胞分化阶段、由一种已分化细胞类型直接转化为另一种细胞类型的细胞分化过程。药物诱导可塑性现象中，常见的谱系转分化现象是神经-内分泌转分化与皮肤-上皮转分化。例如，25%去势抵抗的前列腺癌细胞可发生雄激素受体(androgen receptor，AR)非依赖的细胞谱系转分化，出现神经-内分泌亚型，表现神经内分泌的组织学和分子特征，如AR信号低，TP53和RB1丢失，出现嗜铬粒蛋白A和突触蛋白表达；因此前列腺癌细胞减少对AR信号的依赖，逃逸去势抵抗药物的杀伤攻击[8]。EGFR抑制剂耐药的NSCLC患者中，约3%～14%转分化为SCLC，发生神经-内分泌转分化，且全基因组测序显示转分化前后肺癌细胞的EGFR突变类型相同，均为EGFRT790M，提示并非细胞突变引起的耐药[9]。皮肤-上皮转分化现象方面，靶向药物治疗的基底细胞癌患者其部分细胞表型从转录鼓包样转变为峡部/滤泡间表皮混合型，而在未治疗的患者中该细胞类型不存在，表明其并非来自药物治疗引起的预先存在耐药细胞群如CSCs的筛选富集[10]。

增殖-侵袭表型之间相互转换的可塑性现象常见于黑色素瘤细胞。当黑色素瘤患者接受丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制剂治疗时，黑色素瘤细胞可由增殖型转换为浸润型或进入未分化细胞状态，引发治疗的抵抗性[11-13]。在增殖-侵袭表型转换过程中，耐药性的获得受到转录因子MITF表达水平的调节，肿瘤细胞MITF表达丢失与未分化间充质样侵袭表型或神经嵴干细胞表型的出现相关联[14]。在胰腺癌，吉西他滨抵抗的肿瘤细胞其侵袭迁移能力增强，伴随细胞状态由增殖型向侵袭迁移型转变[15]。

无论何种形式的细胞可塑性，均是在药物治疗后借助表观遗传和/或转录重编程过程，促使细胞状态或表型向新的不同的状态或表型转换的结果，属于肿瘤细胞对抗抗癌药物的非遗传适应性反应。鉴于肿瘤细胞可塑性在药物治疗耐受和抵抗过程中的关键作用，围绕肿瘤细胞与抗癌药物间“战争”亦即“隐藏(表型转换)-寻找(癌症治疗)”的药物诱导细胞可塑性机制成为肿瘤耐药研究备受关注的焦点[1,16]。

3 药物诱导细胞可塑性的DTPs药物耐受机制

药物诱导肿瘤细胞可塑性的分子机制尚未完全阐明。但已经明确的是，细胞形态的转变是个逐步过渡的过程，均需经历一个“缓慢生长”的药物耐受阶段。科研人员最先在NSCLC发现，药物治疗后即使病灶部分或完全缓解，部分肿瘤细胞仍能在药物致死剂量暴露下短暂存活，这些MRD中幸存的药物耐受细胞(drug-tolerant persisters，DTPs)暂时表现为缓慢增殖或不增殖状态，药物治疗停止后则又恢复增殖活性和药物敏感性[1,2,16-17]。反之，若药物治疗持续存在，DTPs则通过重编程甚至不可逆基因改变，成为稳定或永久耐药细胞。在结直肠癌[18]、黑色素瘤[19]、胶质母细胞瘤细胞[20]，研究人员也发现了DTPs的存在。在细胞状态与表型转换的过程中，DTPs的药物耐受/休眠状态允许细胞在被杀死和获得突变的时间窗内短暂生存，是将依赖表型的非遗传适应机制与依赖基因型的突变机制联系起来的“桥梁”，且对获得突变驱动的耐药、进而进化为临床相关的耐药至关重要。因此，DTPs药物耐受机制被认为可能是独立于肿瘤类型、肿瘤治疗方法之外的共性逃逸机制。

从细胞起源来看，DTPs缓慢分裂状态与干细胞的特征相吻合，DTPs可能含有或就是肿瘤中预先存在的CSCs。由于CSCs固有的耐药性包括内在特性如高表达外排药物的转运蛋白、处于静止增殖期，及外在特性如可被微环境刺激因子激活的自我更新信号或/和EMT现象，CSCs可被药物选择富集，表现出治疗的抵抗性，此即DTPs细胞起源的达尔文自然选择学说[1,2,16,21]。体内、外及临床研究均证实药物处理可筛选富集CSCs，且CSCs的先天耐药性决定了DTPs的药物耐受状态，如紫杉醇处理的乳腺癌细胞[22]、吉西他滨处理的膀胱癌细胞[23-24]、卡铂处理的卵巢癌细胞[25]等。运用分子条形码技术，研究人员发现CSCs的先天耐药性源于其借用了胚胎发育的增强子转换机制，即CSCs使用与谱系特异性分化细胞不同的增强子如前驱或辅助因子，通过转录选择机制，维持细胞生存增殖所需关键基因如MYC的表达，进而实现对药物攻击的抵抗性[26]。

在5-氟尿嘧啶处理的结肠癌细胞[27]、替莫唑胺处理的脑胶质瘤细胞[28]、顺铂处理的肺癌细胞[29]，DTPs耐受药物的机制则存在另一种可能性。如，在药物治疗等内、外非遗传信号的刺激诱导下，本身不具备肿瘤起始能力的DTPs通过转录、表观遗传学修饰与代谢重编程等机制获得CSCs表型特征，成为诱导性CSCs或耐药性CSCs，并在药物治疗中持续补充CSCs，用以对抗治疗药物的杀伤攻击，此即拉马克诱导学说[1,2,16]。该学说强调了肿瘤细胞应对药物攻击的主动适应性，又称为治疗触发的适应性(therapy-triggered“adaptation”)。支持此学说观点的证据是：研究人员发现CSCs具有适应环境信号改变的动态性与可塑性。

然而，治疗诱导的细胞状态或表型转换并非是药物敏感与CSCs样药物抵抗、非干性与干性状态的简单、双向转换。研究表明，DTPs可有多个耐受状态。如EMT过程中，上皮与间充质状态之间还存在具有CSCs特性的过渡态；其向上皮、间充质的不同分化程度导致了药物耐受的不同状态[30]。单细胞转录组测序结果显示，黑色素瘤MRD存在对MAPK抑制剂耐受的多种状态：侵袭性或未分化的间充质样黑色素瘤细胞、黑色素瘤神经嵴干细胞(NCSCs)、高度色素或分化状态黑色素瘤细胞和“饥饿样”黑色素瘤细胞。其中，NCSCs是主要的药物耐受状态，其存在与非遗传适应耐药细胞的产生一致，此外，未分化间充质样细胞也可具有耐药性[12]。以上多种耐受状态共存的现象表明，在单细胞水平肿瘤细胞存在药物抗性基因的转录波动即“转录噪声”，小部分肿瘤细胞如CSCs因其抗性基因表达在治疗瞬间超过阈值，被动随机选择并短暂存活下来，呈现达尔文选择现象[16]。当药物暴露时间延长，部分非CSCs细胞可通过表观遗传学修饰主动重编程获得药物抵抗状态，建立含CSCs的DTPs池，这些变化属“后天惯性”，因而又支持拉马克诱导学说。

由此可见，微环境刺激触发、药物压力选择下，自然选择或/和重编程获得的耐药性CSCs可能是不同肿瘤类型DTPs药物耐受的共有机制[1,2,16,29]。尤其是，CSCs重编程导致了DTPs的状态或表型的可塑性，体现了肿瘤细胞对微环境刺激与药物压力的适应性，改变了耐药细胞仅由CSCs产生的单一进化路径，提示CSCs重编程对肿瘤细胞耐药性具有重要的意义。因此，靶向化疗诱导耐药性CSCs的重编程机制可作为未来逆转肿瘤细胞耐药性的新途径。

4 药物诱导细胞可塑性的靶向治疗启示

针对药物诱导细胞可塑性的DTPs药物耐受机制，靶向细胞可塑性可分别从防止、消除和逆转细胞状态或表型转换入手。在预防肿瘤细胞可塑性方面，可采用间歇性给药方式，以防长期用药引起细胞状态或表型转换为永久耐药的状态或表型。例如，Das，等[31]采用间歇性给药方式，黑色素瘤细胞对靶向药物维美拉非尼的治疗反应时间延长了一倍[31]。此外，采用靶向治疗与化放疗、免疫治疗联合的策略，抑制癌基因下游重新激活的关键通路如PI3K、YAP等信号，采用靶向表型转换机制的策略，如DTPs或慢循环周期细胞内源性药物耐受信号通路、新表型转换的表观遗传学机制。

其次，新出现的细胞状态或表型具有对特定药物的敏感性，可作为新的治疗靶点。如，神经-内分泌转分化表型转换机制中，转化的SCLC失去了EGFR的表达，因而对EGFR抑制剂不反应，但可对铂类-依托泊苷有短暂的反应，或对紫杉烷类药物有较高反应率[9,32]，在药物诱导的EMT表型转换机制中，可通过抑制间充质样细胞生存所依赖的谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4，GPX4)，靶向杀伤新出现的耐药间充质样细胞[9]。

最后，细胞可塑性主要通过表观遗传修饰机制调控，因此阻断表观遗传修饰机制可望恢复或逆转耐药细胞对治疗药物的敏感性。表观遗传修饰调控因子如EZH2和REST、细胞重编程转录因子如SOX和BRN2及EMT相关基因通路，都可作为潜在药物开发靶点。

需要注意的是，上述药物诱导细胞可塑性的机制大多数是在体外细胞模型中发现的，在应用至临床前首先需要进行体内模型的观察和验证。另外，参与细胞可塑性调控的表观遗传修饰机制或非遗传适应性机制同时也是机体内环境稳态维持或损伤修复等生理病理过程的重要调节机制。因此，对其靶向抑制时需要考虑其潜在的可能毒性和不良反应。

5 结语

肿瘤细胞非遗传适应性药物抵抗机制的提出极大挑战了基于基因组学的精准医学理念，同时也提示基于基因突变来决策指导癌症的治疗方案可能并非解决肿瘤耐药性的唯一途径。因此，基于针对细胞可塑性或CSCs重编程的治疗策略或将为逆转肿瘤耐药性带来新的希望和突破。未来，单细胞多组学(基因组、表观组、转录组)、空间转录测序、单细胞空间转录组技术的发展，以及体内谱系追踪技术与功能表型、转录因子动态分析技术的联合应用，可为细胞表型可塑性或CSCs重编程研究提供更多的证据，更多的细胞表型转换现象及其动态转换过程将被逐渐揭示，也可为靶向治疗策略提供更多可借鉴的方案。