甲基苯丙胺诱导神经细胞凋亡的研究进展

刘鹏亮，朱婷娜，杨根梦，王上，沈宝玉，董文娟，于浩，李利华，洪仕君，赵永娜

(1.昆明医科大学法医学院，昆明 650500； 2.昆明医科大学药学院，昆明 650500)

甲基苯丙胺又称甲基安非他明、去氧麻黄素，属于苯丙胺类中枢兴奋剂，因其外观呈透明结晶样，纯品像冰糖，俗称“冰毒”，是继海洛因后最为流行的毒品之一。甲基苯丙胺具有成瘾快、复吸率高、精神依赖性极强等特点，长期滥用对神经系统造成显著的毒性作用，并对身体上各器官均有损害，短期大量吸食极易引起猝死。《2019年中国毒品形势报告》指出，目前我国甲基苯丙胺滥用人数占现有吸毒人员的55.2%(118.6万/214.8万)[1]。此外，甲基苯丙胺滥用者共用未经消毒的注射器和不洁性行为，使人类免疫缺陷病毒的感染及传播风险增加，给家庭和社会带来极大危害，现已成为全国乃至全世界亟须解决的公共卫生问题。凋亡是指机体调控自主发生的细胞程序性死亡的过程，是机体生长发育过程中的一种基本生物学反应，在多细胞生物体内去除异常或衰老的细胞中起必要作用，其参与了生物体的进化、内环境的调节以及不同组织器官的发育。多项研究表明，甲基苯丙胺导致的脑部损伤与一些退行性病变(如阿尔茨海默病、帕金森病)所表现的脑部病理变化极其相似[2-6]，而凋亡参与了甲基苯丙胺诱导神经毒性的发生发展过程，但具体作用机制尚未清楚。现就甲基苯丙胺诱导神经细胞凋亡的研究进展予以综述，以期为研究甲基苯丙胺与凋亡相关机制以及发现新的治疗药物的提供依据。

1 凋亡概述

凋亡的概念由Kerr在1972年根据其形态学特征首次提出[7]。细胞凋亡早期细胞质凝结，细胞器之间更紧密，细胞质密度升高、细胞体积缩小，细胞核内染色体降解、凝聚，这也是凋亡最主要的特征。随后细胞膜的连续性中断，细胞核碎裂，细胞被分割成为数个凋亡小体，被周围的吞噬细胞吞噬并消化。凋亡在多细胞生物的组织分化、生长发育及机体稳态的维持中起重要作用。异常的细胞凋亡使正常的神经受到损伤，受损后的神经变性导致多种神经退行性疾病的发生[8]。B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因是调节细胞凋亡基因中的一员，其可以抑制凋亡作用，延长细胞生存时间；而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)基因是凋亡正性调控因子，可以促进细胞凋亡的发生，细胞中Bcl-2和Bax基因的比例可以对细胞凋亡进行调节。凋亡主要表现为胱天蛋白酶(caspase)家族的激活，caspase在神经细胞凋亡中起杀伤蛋白的作用[9]；多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]是一种真核细胞的核内酶，其分子量为113 000，在细胞凋亡过程中，PARP被caspase蛋白水解为分子量为89 000和24 000的两个片段，这两个片段成为细胞凋亡的发生标志。因此，目前可通过检测Bcl-2、Bax、caspase和PARP等相关蛋白的变化来判断细胞的凋亡情况。

2 甲基苯丙胺诱导神经细胞凋亡

体外研究表明，不同剂量甲基苯丙胺(0、1、2、2.5、3、3.5 mmol/L)处理PC12细胞和SH-SY5Y细胞的caspase-11表达量均升高，且caspase-11表达量与甲基苯丙胺剂量在16 h内呈依赖性增加[9]。甲基苯丙胺可以诱导PC12细胞和SH-SY5Y细胞发生凋亡和自噬，并使caspase-3、PARP、CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ)的表达。用1.0 mmol/L甲基苯丙胺处理原代培养的纹状体神经元，观察到caspase-3、PARP和C/EBPβ的表达水平显著增加[10]。Xu等[11]用3.0 mmol/L甲基苯丙胺处理PC12细胞，发现TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)染色阳性细胞数目显著增加，同时凋亡标志物PARP和caspase-3的表达水平有所增加。Huang等[12]发现，甲基苯丙胺可通过C/EBPβ/Tribble同源蛋白3/Parkin/α-syn信号通路促进SH-SY5Y细胞发生凋亡。另有前期研究发现，不同剂量甲基苯丙胺(0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L)处理新生SD大鼠皮质神经元24 h，随着甲基苯丙胺浓度的增加，神经元突触逐渐缩短，胞体逐渐出现皱缩、空泡化，甚至死亡，发现经TdT介导的dUTP缺口末端标记法染色阳性细胞的数量明显增多[13]。Ma等[14]证实，大鼠皮质神经元细胞凋亡数量与甲基苯丙胺呈剂量依赖性，细胞存活率降低。

体内研究表明，甲基苯丙胺可诱导大鼠脑组织caspase-11表达增加，并明显上调凋亡标志物caspase-3和PARP的表达[9]。此外，甲基苯丙胺可增加大鼠纹状体中caspase-3、PARP和C/EBPβ的表达水平[10]。Xu等[11]研究表明，capsase-3信号通路参与了核蛋白1介导的多巴胺能神经元凋亡。Huang等[12]发现，C/EBPβ参与甲基苯丙胺诱导多巴胺能神经元凋亡，且大鼠纹状体中caspase-3和PARP的表达水平增加。由此可见，甲基苯丙胺可以诱导神经细胞发生凋亡。

3 甲基苯丙胺诱导神经细胞凋亡的主要信号传导通路

细胞凋亡的发生和调控与多条信号传导通路有关，主要有外源性的死亡受体途径、内源性的线粒体途径和内质网应激途径等。

3.1死亡受体途径的调控作用 死亡受体是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成员，与相关配体结合后，其内部死亡结构域暴露并聚集，并与caspase-8前体结合并活化caspase-8蛋白，从而引发细胞凋亡。死亡受体有Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2等，目前Fas/Fas配体和TNFR介导的凋亡研究最多。研究发现，TNF-α和Fas配体在神经系统中用过炎症反应诱导神经细胞凋亡[15]。既往研究发现，甲基苯丙胺可致大鼠神经元损伤，并增加大鼠额叶皮质炎症因子TNF-α和白细胞介素-6的表达[16]。研究表明，甲基苯丙胺可促进Fas相关死亡域蛋白向磷酸化Fas相关死亡域蛋白的转化，且甲基苯丙胺的需求量增加，其在海马区的表达明显高于纹状体[17]。Park等[18]用1.0 mmol/L甲基苯丙胺处理SH-SY5Y细胞12 h发现，TNFR、caspase-3、PARP、Bax蛋白表达水平显著升高。此外，Liou等[19]研究证明，甲基苯丙胺会促进心肌细胞的凋亡，同时Fas、Fas配体、TNFR、TNF-α、caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表达水平有所增加，而Bcl-2表达水平降低。可见，甲基苯丙胺可通过死亡受体途径诱导细胞凋亡。

3.2线粒体途径的调控作用 甲基苯丙胺可通过经典线粒体途径诱导细胞凋亡。线粒体途径是大多数脊椎动物发生细胞凋亡的主要形式[20]。Bax蛋白与线粒体通透性转换孔结合使其持续开放，导致细胞膜电位消失，促进细胞色素C(cytochrome C，CytC)的释放并与凋亡蛋白酶活化因子1和caspase-9结合，继而活化下游caspase-3蛋白引发凋亡，而Bcl-2和Bcl-xL通过与Bax竞争性结合线粒体通透性转换孔抑制凋亡发生。研究显示，甲基苯丙胺处理C6细胞的CytC、caspase-9、caspase-3、Bax表达水平升高，而Bcl-xL的表达水平降低，表明甲基苯丙胺可通过线粒体途径诱导细胞凋亡[21]。Chen等[22]研究证明，甲基苯丙胺在体内、体外均可以通过上调来自星形胶质细胞的Lipocalin-2表达增加CytC、caspase-3、PARP、Bax蛋白的表达，从而参与线粒体相关的神经元凋亡。甲基苯丙胺处理PC12细胞和SH-SY5Y细胞用的线粒体膜电位降低，且线粒体内CytC表达明显增加[10]。此外，Huang等[12]研究表明，C/EBPβ可通过Tribble同源蛋白3/Parkin/α-syn信号轴介导甲基苯丙胺诱导的线粒体凋亡。Sharikova等[23]发现，甲基苯丙胺处理HUTU小胶质细胞的CytC、髓细胞白血病因子1、凋亡蛋白酶活化因子1、Bax和caspase-3表达水平增加，证实甲基苯丙胺可通过线粒体途径诱导神经细胞发生凋亡。除CytC介导细胞凋亡外，凋亡诱导因子介导的非caspase依赖的凋亡通路受Bax和Bcl-2调控。有研究证明，甲基苯丙胺也可通过促进凋亡诱导因子表达诱导细胞凋亡[24]。

3.3内质网应激途径的调控作用 甲基苯丙胺可以通过内质网应激途径诱导细胞凋亡。内质网应激可激活未折叠蛋白反应来进行细胞修复，而持续性内质网应激会诱导细胞凋亡。未折叠蛋白反应主要与蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活转录因子6、肌醇需求酶-1有关。内质网应激通过激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)转录、激活c-Jun氨基端激酶信号通路、活化caspase-12三条途径引发凋亡。研究表明，甲基苯丙胺可促进SH-SY5Y细胞发生内质网应激[10]。此外，甲基苯丙胺可通过上调大鼠前额叶皮质和纹状体中核蛋白1和CHOP的表达而激活体内内质网应激[11]。星形胶质细胞来源的Lipocalin-2也可通过PERK介导的信号通路促进神经元凋亡。Shah和Kumar[25]用甲基苯丙胺处理SVGA细胞，发现PERK、转录因子6和肌醇需求酶-1被激活，且激活水平具有一定的时间和剂量依赖性，同时CHOP、caspase-9和caspase-12表达水平增加。甲基苯丙胺处理后，C6细胞的PERK、转录因子6和肌醇需求酶-1被激活，CHOP和caspase-12的表达水平增加[26]。Jayanthi等[24]证明，甲基苯丙胺可通过内质网应激途径诱导神经细胞凋亡，甲基苯丙胺处理后，葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白重链结合蛋白、CHOP和caspase-12的表达水平明显升高，且注射甲基苯丙胺后，大鼠的caspase-12因子立即被激活。除神经系统外，甲基苯丙胺还可通过激活内质网应激诱导细胞凋亡，从而造成肺组织损伤[27-28]。

4 不同药物在甲基苯丙胺诱导细胞凋亡中的调节作用

4.1天麻素对甲基苯丙胺诱导细胞凋亡的调节作用 天麻素是天麻的主要生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑制小胶质细胞活化、调节线粒体级联、调节神经递质、上调神经营养等作用，其对许多中枢神经系统疾病有广泛益处。天麻素对甲基苯丙胺诱导的细胞凋亡具有保护作用。天麻素可以对神经损伤起到很好的保护作用，并通过上调Bcl-2表达、下调Bax和caspase-3表达，进而抑制神经元的凋亡[29-30]。天麻素可通过拮抗上调内质网应激的信号抑制细胞凋亡发生，可能与其抗氧化、抗炎的作用有关[31-33]。既往研究表明，给予天麻素干预并经甲基苯丙胺处理的皮质神经元经TdT介导的dUTP缺口末端标记法染色显示阳性细胞的数量显著减少，且caspase-3表达水平明显降低[13]。此外，天麻素可通过调节环腺苷酸、蛋白激酶A、cAMP反应元件结合蛋白和脑源性神经营养因子的表达改善由甲基苯丙胺诱导的神经细胞凋亡引起的神经毒性作用[14]。Liu等[33]研究发现，天麻素可以减少线粒体膜电位的损失并抑制CytC、Bax和凋亡诱导因子的表达，从而抑制细胞凋亡。自噬和凋亡是两种不同的程序性死亡方式，有研究表明，抑制甲基苯丙胺诱导的自噬可以减轻甲基苯丙胺诱导的凋亡[10]。Yang等[34]研究发现，天麻素可以通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制甲基苯丙胺诱导的SH-SY5Y细胞自噬。

4.2褪黑素对甲基苯丙胺诱导凋亡的调节作用 褪黑素是哺乳动物和人类松果体产生的一种胺类激素，具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗肿瘤等作用。研究表明，褪黑素对甲基苯丙胺介导的神经细胞凋亡有保护作用[13]。同时，褪黑素还可以剂量依赖方式增加Bcl-xl/Bax比值，降低CytC、caspase-9和caspase-3的表达水平，改善甲基苯丙胺诱导的细胞凋亡[21]。此外，褪黑素可通过调节内质网应激抑制甲基苯丙胺诱导的细胞凋亡，并提高神经细胞活性和降低CHOP、caspase-12的表达水平[26,35]。攻击性是甲基苯丙胺使用或戒断后的症状之一，而褪黑素具有逆转甲基苯丙胺诱导的攻击性行为的能力[36]。此外，褪黑素还可通过对谷氨酸受体、突触和脑源性神经营养因子的保护和恢复作用，改善甲基苯丙胺造成的神经损伤和学习、记忆以及认知功能障碍[37]。蛋白激酶Cδ是新型蛋白激酶C家族成员，主要通过特定基因位点的磷酸化和caspase-3的剪切而被激活，从而介导细胞凋亡。Shin等[38]研究发现，褪黑素可通过调节蛋白激酶Cδ基因抑制细胞凋亡，从而降低甲基苯丙胺引起的神经毒性作用。

4.3其他药物对甲基苯丙胺诱导凋亡的调节作用 积雪草酸[18]、人参皂苷Re[38]和木犀草素[39]等药物均能抑制甲基苯丙胺诱导的细胞凋亡。积雪草酸来自中草药积雪草，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎等特性。积雪草酸抑制甲基苯丙胺诱导的TNFR表达具有剂量依赖性，其还可通过增加Bcl-2/Bax比例抑制细胞凋亡，使caspase-3及PARP的表达降低[18]。人参皂苷Re是人参的主要活性成分之一，Shin等[38]研究证实，人参皂苷Re可以通过蛋白激酶Cδ途径抑制线粒体损伤、酶抗氧化系统损伤和小胶质细胞的激活与凋亡来保护多巴胺能神经免受甲基苯丙胺诱导的神经毒性作用。木犀草素是一种黄酮类化合物，普遍存在于水果、蔬菜及草本植物中，在中医药领域广泛应用。木犀草素可通过降低p53、caspase-3、Bax表达抑制甲基苯丙胺对神经系统发挥的毒性作用；并可抑制神经细胞发生自噬，降低Beclin1和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ的表达，这可能是木犀草素保护神经系统的作用机制之一[39]。

综上所述，甲基苯丙胺可诱导神经细胞凋亡，而天麻素、褪黑素、积雪草酸、人参皂苷Re和木犀草素等主要通过较强的抗氧化性抑制甲基苯丙胺诱导的凋亡和神经毒性，证实甲基苯丙胺可通过激活氧化应激诱导神经毒性作用，为寻找甲基苯丙胺戒断干预治疗药物和作用靶点提供了依据。

5 小 结

细胞凋亡是多细胞生物体内的正常生理反应，正常的凋亡可以清除体内的异常细胞，维持内环境稳定，异常的凋亡在导致机体损伤中发挥重要作用。甲基苯丙胺通过促进死亡受体途径、线粒体途径和内质网应激途径相关因子的表达诱发异常的神经细胞凋亡，从而诱导神经毒性作用，其具体调控机制尚不清楚。因此，探究甲基苯丙胺毒性作用与凋亡之间的机制、信号传导通路和关键作用蛋白，可为甲基苯丙胺依赖者的靶向治疗提供新思路和新方法，并将成为该领域的研究方向和最终目标。