miR-140与Beclin1在不同退变软骨组织的表达及相关性研究

董龙家 丁家秀 史学形 余立钦 张卫△

(1.贵州医科大学附属白云医院骨科，贵州 贵阳 550014; 2.贵州医科大学附属医院， 贵州 贵阳 550004;3. 贵阳市第一人民医院老年医学科，贵州 贵阳 550002 )

骨关节炎是以关节软骨持续破坏为特征，导致关节软骨细胞外基质合成和降解失衡。microRNAs (miRNAs)是一类小的(约22个核苷酸)非编码RNA。它可以通过靶向mRNA互补、阻断mRNA裂解或蛋白翻译来调节基因表达。最近的一项利用血清microRNA阵列分析的研究[1]证实miR-140是一个潜在的骨关节炎生物标志物。miR-140的异常调节与骨关节炎的严重程度有关，同时miR-140抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡和炎症[2]。研究[3]证实，软骨细胞的自噬对正常软骨细胞具有保护作用，提高软骨细胞的自噬水平可减缓骨关节炎的病程。然而miRNAs与自噬的相关性研究却很少有报道。本研究通过检测不同退变程度的软骨内miR-140与beclin1的表达情况，分析miR-140与细胞自噬的相关性，为临床治疗膝骨关节炎提供新的理论基础和靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9月至2018月12月31日贵州医科大学附属白云医院因骨关节炎(OA)行膝关节置换患者20例，依据Kellgren&Lawrence(K&L)分级标准分级，Ⅲ级10例，男2 例，女8 例，年龄57～75 岁，平均(65.3±4.4)岁；Ⅳ级10例，男3 例，女7 例，年龄58～79 岁，平均(66.3±3.8)岁；对照组为股骨颈骨折行髋关节置换的正常股骨头软骨10例，男4 例，女6 例，年龄62～78 岁，平均(67.2±3.6)岁。软骨取材位置：OA为股骨外侧髁，股骨头为顶部。所有患者均征得知情同意，并经过贵州医科大学附属白云医院伦理委员会同意。OA组骨关节炎的诊断依据美国风湿病学会的标准，患者既往体健，否认风湿、类风湿性关节炎、膝部外伤手术史，符合OA 临床表现、影像学诊断标准。对照组患者既往体健,否认既往关节疾病史，此次股骨颈骨折患者,根据影像学、临床表现排除OA。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1标本处理 所取标本全部以10%中性甲醛溶液固定72 h，于10%硝酸混合液(10%硝酸+10%中性甲醛+60%双蒸水)中脱钙48 h，常规脱水，石蜡包埋，5 μm厚度连续切片。三组切片均行HE、Masson和番红/固绿染色，光镜下观察软骨、钙化层和软骨下骨病理改变情况。

1.2.2实时荧光定量PCR法检测软骨基因miR-140、Beclinl 取软骨组织100 mg置于1.5 mL离心管中，加TRIzol 1 mL，充分匀浆，室温静置5 min，加入氯仿0.2 mL振荡、离心，取上清液加入异丙醇0.5 mL离心，弃上清液，加人75%乙醇1 mL沉淀、晾干，获取纯化RNA。RT反应：(1)在0.2 mL EP管中，加入总RNA(质量为3 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL、DEPC水补足至12 μL，轻轻混匀、点动离心；(2)PCR仪上65℃加热5 min，立即冰浴3 min；(3)在上述EP管中加入5×反应缓冲液4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、核糖核酸酶抑制剂1 μL、TMM-MuLV反转录酶1 μL；(4)42℃ 60 min，70℃ 5 min；(5)取出上述反应液，即为cDNA，—80℃保存备用。荧光定量PCR反应：取出上述反应液1μL作为荧光定量的模板，反应体系如下：2×实时定量荧光PCR预混物5μL；正向引物，10 μmol/L1μL；反向引物，10 μmol/L 1 μL；模板DNA 1 μL；核糖核酸酶游离水2 μL，反应总体积为10 μL；反应条件如下：95℃ 5 min(步骤一)，95℃ 10 s(步骤二)；60℃ 30 s(步骤三)；步骤二和三40个循环。本次实验所使用的分析方法为相对定量分析，所采用的指标为：2-△△Ct。miR-140、Beclin1引物序列见表1。

表1 miR-140、Beclin1引物序列与预扩增长度

1.2.3Westernblot 检测软骨miR-140、Beclinl蛋白表达 软骨样本，在冰面上用干净的剪刀解剖组织。向试管中快速加入300 mL NP40冰冷裂解缓冲液(150 mM氯化钠，1.0%NP-40，50 mM Tris pH8.0)，并用电动均质器均质；每个样品都加入更多的裂解缓冲液(400 μL)，并在冰箱的轨道振荡器上保持4°C恒定搅拌2 h；然后，试管在4°C下以12 000转/分的速度离心20 min，轻轻地从离心机上取出试管放在冰上，吸出上清液，放入冰冻的新鲜试管中；提取蛋白质，上样、电泳、转膜、封闭后，一抗二抗孵育参考说明书，室温封闭2 h；加入洗涤液(TBST)，每次洗涤10 min，共洗涤3次；蛋白检测参考相关说明书，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白；采用Image J软件进行分析。

2 结 果

2.1不同软骨组织HE、masson、番红固绿染色结果 与股骨头正常软骨组织相比，OA组软骨组织的HE染色、Masson染色、番红固绿染色显示关节软骨出现退变退变，且退变程度与Kellgren&Lawrence(K&L)分级标准分级相一致。见图1。

图1 不同软骨组织HE、masson、番红固绿染色结果

2.2miR-140、Beclin1在不同关节软骨组织中的表达情况 通过RT-PCR、Westernblot 检测软骨组织中miR-140、Beclin1的表达量，发现OA软骨组织miR-140、Beclin1表达水平明显低于股骨头正常软骨组织(P<0.01)，见图2；OA组软骨依据Kellgren&Lawrence(K&L)分级，退变程度越高，上述两种基因表达量越低(P<0.01)，见图3。

2.3miR-140、Beclin1表达水平相关性 不同软组织miR-140、Beclin1表达水平，两者的表达具有正相关性(r=0.638，P<0.05)。见图4、图5。

3 讨 论

MicroRNAs是RNA的非编码小片段，在细胞水平上具有重要的调节功能。这些分子很容易在人体组织和循环中被检测到。S.W.Jones等在2009年首次将miRNA与OA联系起来，该研究将膝关节置换过程中移除的人软骨和骨中miRNA的表达与既往没有关节疼痛的捐赠者的尸检样本中的表达进行了比较[4]，显示出在病变组织与正常组织的差异表达为4倍以上。本研究也证实正常软骨内miR-140的表达明显高于OA组，且随着软骨退变程度增加，miR-140的表达越发降低。miR-140在软骨中高表达与正常软骨发育有关，它似乎是正常软骨内骨发育所必需的[5]。在OA组织中miR-140的表达减少，体外用IL-1b处理软骨细胞也抑制miR-140的表达，软骨细胞中miR-140的敲除易导致以蛋白多糖和胶原蛋白丢失为特征的年龄相关性OA改变[6-7]。miR-140的其他功能包括调节(通过转录后抑制)胰岛素样生长因子结合蛋白-5(IGFBP-5)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)，这两种蛋白都参与了软骨OA的病理[8]。最近研究[9]认为OA患者Mir-140-5p表达下调，HMGB1表达上调。MIR-140-5p通过靶向HMGB1抑制PI3K/AKT信号通路，抑制OA的进展。

X.H.Liang等[10]在致死性Sinbis病毒性脑炎的大鼠体内发现了一种蛋白质，其相对分子质量为60 000，并将编码该蛋白质的基因命名为beclinl。V.M.Aita等[11]发现编码该蛋白的基因beclinl位于人染色体17q21，并将其成功克隆。软骨表面区是迄今检测到的所有自噬调节因子中表达最强的，包括ULK1、Beclin-1和LC3。B.Caramés等[12]研究发现beclinl基因和微管相关蛋白轻链3(LC3)在人体软骨细胞中正常表达，而在关节炎软骨细胞中表达减少，且这两种基因的相关蛋白在骨性关节炎中表达降低。本研究也证实正常软骨内Beclin-1的表达明显高于OA组，且随着软骨退变程度增加，Beclin-1的表达越发降低。T.Vellai[13]发现，软骨退变中的软骨细胞内的细胞器及大分子物质降解严重，使细胞的正常功能和生存能力下降。而由beclinl基因调控的细胞自噬可清楚细胞内受损的细胞器和降解的大分子物质，减少积累，来维持细胞的稳态，促进软骨细胞的生存。因此，细胞自噬可能缓解或阻断关节软骨退变和骨关节炎的发展。研究[14]发现通过雷帕霉素激活软骨细胞的自噬作用，使其自噬活性增强，可使鼠膝关节炎中的软骨细胞死亡得到阻止。

通过实验[15]验证，发现miR-140确实存在与ULK1基因的结合位点，经过miR-140-5p干预的野生型ULK1组细胞， 其相对荧光素酶表达活性明显降低。当运用miR-140-5p抑制剂干预后，其ULK1蛋白表达明显升高。本研究通过统计学分析两者表达的相关性，得出两者呈正相关关系。miR-140可能通过某种信号通路影响Beclin1的表达而引起软骨的退变。这说明，miR-140可以靶向调控自噬基因的表达。然而，值得注意的是，当miR-140升高会抑制骨关节炎关节软骨细胞外基质降解，这对于缓解膝骨关节炎是有利的，同时它又抑制了ULK1表达进而可能抑制了软骨细胞自噬，这对于缓解膝骨关节炎是不利的。

(本文图2～图5见封三)