基于1H-NMR技术的2型糖尿病代谢组学研究进展

郑芳萍，高碧珍，陈学勤

(1.福建中医药大学附属厦门中医院内分泌科，福建 厦门 361001； 2.福建中医药大学，福州 350122； 3.厦门大学附属第一医院中医科，福建 厦门 361003)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一种代谢紊乱的慢性高血糖疾病，其特征为碳水化合物、脂质和蛋白质代谢的改变。据统计，目前全世界T2DM患者达5亿以上，而中国约占1/3[1]，已成为继心脑血管疾病、肿瘤后严重危害人类健康的第三大慢性疾病，其导致的多种并发症是糖尿病致残、致死的主要原因[2]。T2DM患者从发病前期、患病再到出现各种并发症，机体内发生了一系列复杂的代谢变化。以往对于T2DM的研究方法主要以分子生物学和生物化学为主，易忽略整体器官中动态的代谢变化过程，对该病的发病机制研究和认识具有一定局限性，也难以做到早期预测。而代谢组学作为一种系统的研究方法，可识别生物体的整体代谢变化，是系统生物学的重要组成部分，近年来在医学、药学、生物学等领域得到广泛应用[3-4]。其中，核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H-NMR)代谢组学能够对样本进行动态监测，为T2DM及其并发症的预测、作用机制、临床诊断及药物疗效等的研究提供了新思路。现就1H-NMR技术在T2DM发病机制、相关并发症及中医药治疗代谢组学研究中的应用予以综述，以期为深入研究提供参考。

1 基于1H-NMR技术的代谢组学概述

代谢组学兴起于20世纪90年代末，是继蛋白组学、基因组学后的一门新兴学科，用于研究生物体系(细胞、组织或生物体)内源性代谢物种类、数量及变化规律，可揭示机体生命活动代谢本质[5]。其研究对象主要是分子量为1 000以下的小分子化合物。目前常用的代谢组学技术包括气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用和核磁共振技术，各有优缺点。与质谱相比，核磁共振具有样品处理简单、无损伤性、测试手段丰富，定性与定量分析、无偏向性、分析快速等独特优势，是化合物定性分析中最重要的方式，近年来得到广泛应用，成为临床医药研究领域的重要工具[6]。而核磁共振又以1H-NMR和核磁共振碳谱应用最为广泛。1H-NMR的原理主要是通过利用特定频率的电磁波，使氢原子发生能级跃迁，产生的磁频率信号经过转换放大在谱图上以峰的形式体现。核磁定性的基本方式是利用分子中含氢基团的化学位移和谱峰裂分情况，对化合物的分子结构进行判断。然后通过一系列样品的图谱，可以判断生物体的病理生理状态、基因的功能、药物的毒性和药效等，并可能找出与之相关的生物标志物和代谢途径。近年来，采用1H-NMR发现T2DM潜在生物标志物是代谢组学的研究热点之一，可以极大提高对T2DM发生机制的微观了解，监测药物疗效及毒性，从而促进T2DM的预测、诊断、治疗等领域的发展。

2 基于1H-NMR技术的T2DM发病机制研究

T2DM与体内多种物质代谢紊乱有关，如脂质、氨基酸、碳水化合物等，通过1H-NMR技术有助于了解患者体内代谢物的异常特征，对于进一步认识T2DM的发病机制，预测疾病发生发展至关重要，同时也可为临床诊断提供新途径。红细胞是一种独特的机体细胞，参与氨基酸等营养物质的运输和传递，而血糖是成熟红细胞代谢的唯一能源，因此红细胞的代谢物运输在T2DM中容易受到损害[7]。Palomino-Schätzlein等[8]通过1H-NMR技术研究T2DM患者红细胞代谢谱，发现与健康人群不同的代谢产物包括谷胱甘肽、2,3-双磷酸甘油酸、肌苷酸等氨基酸。但由于血细胞不容易提取分离，而血清代谢组学更容易操作和检测，因此血清成为代谢组学中最常用的样本。Del Coco等[9]采用1H-NMR技术区分了T2DM和T2DM并发症之间的血清代谢特征，从T2DM患者中检测出8种生物标志物，包括丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，而异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸和缬氨酸这5种代谢物可作为T2DM并发症患者的生物标志物。可见，T2DM无并发症与有并发症患者体内的代谢途径存在差异。此外，由于尿液中含有的化学物种类较多，可以反映代谢紊乱，因此尿液在代谢物谱研究中也是一种关键的生物基质。Guan等[10]研究发现，糖尿病大鼠的尿代谢产物与正常大鼠明显不同，包括与能量代谢、三羧酸循环和甲胺代谢有关的尿代谢产物。张志军等[11]应用1H-NMR技术检测T2DM患者尿液的代谢轮廓，图谱显示与T2DM有关的代谢物包括乙酸、牛磺酸、乙酰乙酸、柠檬酸、三甲胺等，表明T2DM的发生发展与糖代谢紊乱、氧化应激、氨基酸及脂类代谢异常、维生素缺乏密切相关。Ahola-Olli等[12]用1H-NMR代谢组学测量4个芬兰人群共11 896人中的229种循环代谢指标，对基线代谢物与8～15年随访期间(392例)糖尿病风险的关联进行了调整，结果发现有113项代谢物与糖尿病有关。

以上研究表明，T2DM患者无论是血清、红细胞还是人体排泄物中，均可检测出多种与T2DM发生发展相关代谢途径的生物标志物，这些代谢物可以预示人们患糖尿病风险的趋势，有助于研究者寻找可预测T2DM致病机制的标志物，同时也扩展了更多了解T2DM代谢途径的渠道。而全方位的代谢谱分析不仅使疾病发病机制更加客观化、可视化、微观化，还有助于针对风险较高的无症状个体进行预防性干预。

3 基于1H-NMR技术的T2DM相关并发症研究

T2DM后期可引起一系列并发症，易造成器官组织毁损，具有致残、致死性。由于T2DM的预后高度依赖于并发症的发展，1H-NMR可以辅助疾病进行诊断、分型、分级和分阶段，因此用微创技术鉴定T2DM并发症进展的生物标志物具有重要的临床价值。目前临床多将糖化血红蛋白作为糖尿病控制的监测指标，糖化血红蛋白水平越高，提示患者发生糖尿病相关并发症的风险越大。然而，糖化血红蛋白在预测糖尿病相关慢性并发症方面无特异性，且不能捕捉到与血糖本身无关的葡萄糖变异性和其他代谢变化，这使得探索新的生物标志物成为预测糖尿病进展的一个重要领域[8]。有研究证实，有糖尿病相关并发症患者血浆中的三羧酸循环、甲胺代谢、能量代谢物和氨基酸受到显著干扰[13]。近年来，1H-NMR技术在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)及脑血管神经病变研究中取得较大进展，成为监测代谢物变化和预测疾病发生发展的重要手段。

3.1DR DR早期无任何症状，随着病程进展，可导致失明。Santiago等[14]采用1H-NMR技术研究糖尿病对大鼠视网膜中间代谢产物水平的影响，发现糖尿病大鼠视网膜中葡萄糖显著增加，乳酸盐显著减少，表明糖尿病可能会显著降低视网膜的糖酵解，从而导致患者视力下降。Jin等[15]对糖尿病伴白内障、DR伴白内障和老年性白内障患者的房水进行了基于1H-NMR的代谢组学研究，结果发现，乳酸、2-羟基丁酸、琥珀酸等代谢物可能在DR的发生发展中发挥作用。Barba等[16]通过1H-NMR的代谢组学分析糖尿病伴视网膜病变患者玻璃体液的代谢特征，结果显示乳酸是最丰富的代谢产物，具体表现为乳酸和葡萄糖水平升高，半乳糖醇和抗坏血酸水平显著降低。由于视网膜、房水、玻璃体等样本在临床较难获得，在研究上存在一定的困难，目前研究较少且不成熟，未来仍需要更多大样本、多中心研究来支持。但以上基于1H-NMR代谢组学的研究仍可在一定程度上说明DR患者的能量代谢和氨基酸的代谢途径发生了改变，这有助于探索DR患者新的发病机制。

3.2DN DN是糖尿病严重的微血管并发症之一，也是终末期肾病最主要的原因，严重影响患者的生命健康和生活质量。孙立业等[17]研究认为，DN小鼠体内存在氨基酸代谢和能量代谢异常，从而导致肾脏受损。廖成彬等[18]通过1H-NMR技术检测尿液代谢组学特征，发现随着DN病程的进展，体内能量代谢、氨基酸代谢、脂代谢、三羧酸循环及肠道菌群会发生显著变化。Tian等[19]对从糖尿病大鼠获得的尿液和肾脏组织样本进行了基于1H-NMR的代谢组学分析，共筛选出9种与肾功能密切相关的差异代谢产物，它们主要与酮体的合成和降解，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢以及丁酸酯的代谢3个代谢途径相关，涉及甲胺代谢、能量代谢和氨基酸代谢。魏婷婷等[20]研究认为，DN的发病与三羧酸循环、糖酵解途径和脂类代谢途径受到不同程度抑制以及糖异生作用增强有关，异常代谢产物包括丙酮酸、乳酸、柠檬酸等，并提出胆碱可能是与DN相关的潜在生物标志物。目前通过1H-NMR技术已识别出影响DN发生发展的某些代谢产物，而这些显著差异的代谢产物能否作为判断其进展的生物标志物尚未明确，但仍可为未来DN的早期诊断和探索发病机制提供新方向。

3.3糖尿病脑病(diabetic encephalopathy，DE) 糖尿病可引起认知、记忆等大脑功能障碍以及大脑的神经生理改变，进展为DE，但其潜在代谢机制仍不清楚。有研究显示，脑病的发生发展与脑能量代谢紊乱密切相关[21]，1H-NMR代谢组学可以通过监测血清、血浆甚至脑组织、脑脊液的代谢变化特征，揭示疾病病理生理机制。王丹等[22]基于1H-NMR技术发现，糖尿病大鼠不同发病阶段额叶和枕叶两个脑区的代谢变化主要涉及能量代谢紊乱、谷氨酸-谷氨酰胺-氨基丁酸循环抑制、渗透压调节增强3个方面。Zheng等[23]认为，糖尿病大鼠的认知功能障碍可能与大脑区域特定的代谢改变有关，基于代谢通路分析发现，这些变化涉及能量代谢、神经递质、膜代谢和渗透压调节。DE较轻者会出现反应迟钝、记忆力下降及认知功能障碍等，但严重者会出现脑血栓、脑卒中及老年痴呆等，这可能与机体的代谢发生改变有关。马红等[24]在T2DM合并脑梗死的患者血清中检测出极低密度脂蛋白、葡萄糖、丙酮酸等特征代谢物，说明脂类代谢、糖代谢、氨基酸代谢的紊乱可能在DE中发挥作用。一项前瞻性代谢组学研究指出，T2DM患者脑循环中有氧代谢降低，无氧糖酵解增加，其中T2DM患者脑脊液中的丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、乳酸、丙酮酸水平显著升高，组氨酸水平显著降低，这可为T2DM患者中枢神经病变的代谢紊乱提供临床参考价值[25]。另有研究表明，慢性应激暴露可介导糖尿病大鼠杏仁核中一些主要的神经递质和能量代谢相关的神经化学发生改变，包括乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺等[26]。以上研究说明，DE患者不同的大脑区域呈现不同的代谢特征，表现出特定区域的糖尿病性脑损伤，这些发现为T2DM慢性应激相关神经功能障碍的潜在代谢机制提供了新见解。

4 基于1H-NMR技术在T2DM中医药治疗中的研究

1H-NMR技术不仅可用于疾病预测、疾病诊断、了解发病机制，还可以识别药物作用靶点、监测药物疗效以及指导药物治疗等。T2DM是一种可防可控的疾病，在了解其代谢紊乱机制的基础上，可通过1H-NMR技术针对性监测药物在患者体内发挥作用的途径，这对于精准化药物治疗具有重要意义，特别是近年来该技术在T2DM中医药治疗方面也有十分重要的应用和突破[27]。Guo等[28]采用基于1H-NMR的代谢组学和网络药理学研究黄芪-山药对T2DM大鼠的降糖作用，代谢谱分析发现T2DM的调控主要与黄芪-山药中的18种活性物质有关，其作用靶点有135个，其中有4个靶蛋白可能是黄芪-山药治疗T2DM最相关的靶点。一项研究采用1H-NMR评价不同品种三角蕨的降糖作用，结果发现治疗30 d后糖尿病大鼠的血糖恢复至正常水平，同时生化指标也显著改善[29]。现代“微生物-肠-脑”学说认为，T2DM发病与肠道菌群失调密切相关，通过饮食、药物干预调节肠道菌群可以改善高血糖状态[30]。而通过1H-NMR技术分析肠道代谢状况，可以间接监测药物对肠道菌群的影响，这对于寻找治疗糖尿病的中药以及疗效评价十分重要。有研究通过16S核糖体DNA测序和1H-NMR分析灵芝多糖对T2DM大鼠肠道微生物群和粪便代谢物的影响，结果显示灵芝多糖能够恢复T2DM大鼠肠道细菌群落紊乱的氨基酸代谢、碳水化合物代谢、炎症物质代谢和核酸代谢，从而显著降低空腹血糖和胰岛素水平[31]。另有研究基于1H-NMR技术探讨中药人参煎对T2DM模型大鼠血清和尿液代谢组学的影响，干预后发现糖尿病大鼠的代谢表型恢复至正常范围，表明人参煎对T2DM胰岛素抵抗大鼠具有治疗作用[32]。总之，基于1H-NMR技术的代谢组学研究可将药物在T2DM患者体内的作用进行微观化、可视化、简单化，未来该技术可用于挖掘具有降糖作用的中药及中药成分，可能成为阐明药物作用机制的有力工具。

5 结 语

T2DM虽以高血糖为特征，但机体的整体代谢，如糖、脂类、核苷酸、氨基酸、有机酸等以及与之相关的代谢通路均受到严重干扰。而基于1H-NMR技术的代谢组学在T2DM及相关并发症的防治研究中展现出巨大潜力与应用价值，随着1H-NMR代谢组学方法的检测水平不断提高，目前已经识别了大量与T2DM发展密切相关的新型潜在的生物标志物，对T2DM的早期诊断、监测病程发展、预测疾病以及寻找特定药物产生深远影响。但现有研究仍存在一些不足：①当前关于1H-NMR在T2DM并发症中应用的研究较少，论据不足，未来仍需更多研究证实该技术的价值。②由于代谢谱数据范围较大，目前尚没有公认的可作为T2DM及其并发症早期预测的生物标志物数据库，若能进一步验证这些特异性代谢标志物在T2DM及其并发症的发生发展过程中产生的影响，尽可能明确统一标准，可为T2DM的早期诊治提供有力参考，从而有利于降低T2DM的发病率和致死率。③现有研究多以疾病某个静态代谢状态进行研究，而T2DM的发生发展是一个动态过程，有些代谢异常贯穿于整个疾病的始终，因此监测整个T2DM发生发展过程中的内源性代谢变化显得尤为重要，对T2DM的预防、诊断和治疗具有重要意义。