脂肪来源干细胞在泌尿外科疾病中的研究进展

金琦，彭程，王志平

(兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室 甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，兰州 730030)

多能干细胞是一类可以多向分化、自我复制的干细胞，干细胞一般分为胚胎干细胞和自体干细胞两种。脂肪组织是一种可广泛获取同时对患者影响较小的自体干细胞来源，脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)具有很好的免疫兼容性且无伦理问题[1]，在免疫调节和组织修复方面甚至优于骨髓来源的干细胞，且临床前试验和临床试验无任何严重不良反应[2]。目前，在泌尿外科疾病的治疗中，已有的金标准方法仍存在许多问题，如膀胱全切手术后的尿路重建采用回肠代膀胱术的传统重建方式[3]，且术后会出现多种并发症(如麻痹性肠梗阻、感染、电解质紊乱)[4-5]，极大影响患者术后近期和远期的生理功能恢复。自Zuk等[1]首次发现人脂肪组织中含有可以多能分化的干细胞以来，自体干细胞疗法作为一种全新的疗法为泌尿系统术后重建提供了新思路。目前ADSC在泌尿外科疾病中的研究和应用广泛，涵盖了泌尿系统损伤的修复与重建、压力性尿失禁、膀胱过度活动综合征等泌尿外科主要领域[6]，且研究已深入其作用的分子生物学机制及信号通路，是泌尿外科分支学科发展的一个全新方向。现就ADSC在泌尿外科疾病中的研究进展予以综述。

1 ADSC概述

脂肪组织是人体内储存能量的重要组织，具有含量丰富和容易获得的优点。而ADSC作为脂肪组织中一种独有的自体干细胞，采用其治疗相关疾病，不仅避免了排斥反应或需要采用免疫抑制剂的问题，也具有自身独特的提取、培养方法和生物学特性。

1.1ADSC的提取与培养 收集手术中切除的脂肪组织用无菌剪刀切碎，将切碎的脂肪组织加入胶原酶溶液中，在37 ℃下摇动溶液10～25 min，接着在4 ℃以下以1 000 r/min离心10 min，提取脂肪上清液后加入缓冲液在4 ℃和1 000 r/min下离心，以去除混有的红细胞，然后在37 ℃和5%二氧化碳条件的培养瓶中培养约6 h，一旦发现大量ADSC黏附在培养瓶表面，即可用无菌磷酸盐缓冲液冲洗掉未黏附的细胞，加入新鲜的培养基[通常含有10%的血清、抗生素(链霉素或青霉素)和微量的地塞米松][7]。总之，ADSC具有来源组织易获取、培养简单的特点，无论是在科学研究方面，还是未来大规模应用方面均具有其他间充质干细胞所不具备的优点。

1.2ADSC的生物学特征 一般情况下，由脂肪组织提取出来的在培养瓶表面贴壁生长的细胞通常由若干种细胞组成，如造血干细胞、ADSC、内皮细胞、红细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等，但通过流式细胞技术可以鉴定出ADSC独特的表型。与其他间充质干细胞一样，ADSC表达CD90、CD73、CD105、CD44，不表达CD45和CD31，通过表面标记CD36阳性和CD106阴性可将其与骨髓间充质干细胞鉴别开[8]。Zimmerlin等[9]开展的一项关于ADSC表型的研究也证明了ADSC表达CD90、CD73和CD105。Zha等[10]首次发现了CD49f分子在ADSC上表达，且表达CD49f分子的ADSC亚群的黏附、增殖、迁移、抗凋亡、脂肪形成和成骨分化能力均明显增强。故对于ADSC表型的深入研究，有助于更加深入了解ADSC的功能及开展ADSC相关的干细胞治疗。ADSC是起源于脂肪组织的血管基质的多能干细胞，可以分化为多种细胞类型，如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等，其容易获得的组织和可以多能分化的特性，使其在切口愈合、骨骼再生、心肌重建等再生医学领域被广泛使用[11]。Yang等[12]的研究表明，ADSC可以在特定的成骨培养基培养下向软骨细胞及成骨细胞方向分化，外泌体微RNA可以促进这一效应。Wang等[13]开展了一项利用ADSC制备人工小直径弹性血管壁的研究，发现接种在聚乙醇酸无纺布网内的ADSC在生物反应器中培养并接受脉冲刺激8周，ADSC向平滑肌细胞方向分化，可以形成与天然血管相似的组织结构。因此，可以利用ADSC多向分化的特性，特异性地去诱导构建不同的人工组织及器官用于临床的损伤后修复。

2 ADSC在泌尿外科疾病中的应用

随着当前疾病治疗手段与理念的不断变化，干细胞疗法在泌尿外科疾病治疗中的应用越来越广泛。而ADSC由于提取方便、来源广泛、分化方向多元化的独特优点，近年来成为泌尿外科领域研究的热点，尤其是在膀胱修复与重建、男性勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)、压力性尿失禁、缺血再灌注损伤、泌尿系肿瘤等方面取得一定进展。

2.1膀胱受损 膀胱功能受损可能由多种原因造成，如先天性、肿瘤相关性、感染、医源性、放射线的影响等[14]。大多数情况下，手术切除膀胱利用自体肠管进行重建是首选的治疗方式，但是这种方式并不符合人体原有的生理状况，会产生许多术后并发症，甚至严重影响患者生活质量。Moreno-Manzano等[5]的研究表明，与单用脱细胞膀胱基质相比，人ADSC整合到脱细胞膀胱基质中新膀胱组织的再生显著改善，不伴有肌肉挛缩和钙化，同时周边生长有血管和神经簇与有功能的组织相适应。但ADSC与脱细胞膀胱基质相互作用的分子作用机制仍需深入研究。Smolar等[15]证明了预分化的平滑肌样ADSC与平滑肌细胞以1∶1的比例培养能产生更多类似平滑肌的器官，增加平滑肌的收缩能力。Salemi等[16]将ADSC诱导分化为平滑肌细胞，3周后观察发现诱导后的ADSC平滑肌蛋白大量表达，且最后分化形成的平滑肌组织具有足够的生物强度。也有研究将人ADSC种植于多聚丙交酯-乙内酯共聚物的薄膜上用于改善逼尿肌切除的膀胱功能取得了良好效果，且膀胱顺应性和收缩性均有很好的恢复[17]。未来ADSC联合新型材料可能应用于膀胱全切术后患者的器官重建，恢复膀胱的收缩功能。此外，3D打印器官技术也可通过ADSC向平滑肌细胞分化的功能结合相关聚合物和生长因子来实现相关器官的打印[18]。Moreno-Manzano等[19]使用胃蛋白酶消化脱细胞的猪膀胱制备了一种生物凝胶，这种凝胶有利于ADSC在体外自发地分化为平滑肌细胞，可用于在组织工程中恢复人膀胱泌尿肌的收缩能力。但是其他动物产生的类似凝胶是否对ADSC有诱导分化的潜能尚待研究。Smolar等[20]用ADSC与压缩胶原蛋白水凝胶进行1∶1共培养，结果显示ADSC与压缩胶原水凝胶共培养在体外可增殖形成具有高生存力的天然平滑肌组织，将其移植入膀胱逼尿肌部分切除大鼠的膀胱中进行体内培养8周后，在再生的膀胱壁中出现含有所有膀胱壁逼尿肌成分的多层结构。表明ADSC与压缩胶原蛋白结合具有足够的再生潜力，可以在体内实现再生膀胱壁组织，是未来实现膀胱重建的重要研究方向。可见，ADSC与新兴骨架材料(脱细胞基质、生物凝胶、多聚物材料等)的联合应用，与平滑肌的共培养以及与3D打印技术结合等是未来ADSC在泌尿外科膀胱重建中的研究热点。

外语学习者常常会出现交际现场的望而却步，想尝试却又羞于开口或是不敢开口说。这种时候并不是他们真的缺乏口语表达的能力，而是迫于不能承受因万一失误而出错就会在他人面前丢了面子的心理压力。这种不自信，一方面是由于对自己外语语言能力的不确定；另一方面还是因为平时应用该语言的机会太少，无论是语言的熟练度还是心理的承受力都需要相当一段时间的适应。消极的心理暗示若不及时阻止就会极大地阻碍口语输出的顺利进行。而最有效的心理疏导方式就是让外语学习者多接触纯正的目的语应用语境，让他们在真实的语言环境中慢慢放下戒备和恐惧，自然而然地融入交流的过程，从尝试表达到能无拘无束地自由畅谈。

2.2ED 可能导致ED的两个最常见病因是动脉粥样硬化和糖尿病，另外还有肥胖及勃起神经受损、药物、情绪等，主要的治疗方法包括改变生活方式、药物和心理治疗等，但仍会影响很多男性的生活质量[21]。高表达血管内皮生长因子和胶质细胞源性神经生长因子的ADSC对大鼠双侧海绵体神经损伤引起的ED具有快速修复作用，其中海绵体神经损伤后进行性的阴茎纤维化是ED治疗困难的关键，而ADSC移植后2周勃起功能基本恢复，不仅防止了阴茎纤维化，还保护了血管内皮[22]，有望成为一种全新的治疗方式。有学者将磷酸二酯酶5型小干扰RNA导入慢病毒载体转导至ADSC，结果显示转导组的细胞胰岛素样生长因子1和血管内皮生长因子高表达，且将该组细胞注射入构建的1型糖尿病引起ED的大鼠模型中，其勃起功能得到更好的恢复[23]，但该研究得出的实验结果是否对2型糖尿病导致的ED同样有效，且导入磷酸二酯酶5型小干扰RNA的ADSC改善勃起功能的时间长短尚不清楚，需进一步研究。Jeon等[24]的研究表明，ADSC联合低能量冲击波对前列腺切除后ED大鼠勃起功能恢复有一定的促进作用，其机制为ADSC促进损伤海绵体神经恢复，低能量冲击波促进海绵体血管形成，神经与血管的恢复在预防海绵体平滑肌萎缩和凋亡中起关键作用，进而改善勃起功能。低能量冲击波一般通过空化效应、应力效应和对自由基的影响起作用，其与ADSC协同作用促进损伤的修复未来需深入研究。在前期临床研究方面，一项纳入17例根治性前列腺切除术后ED患者的Ⅰ期临床研究结果显示，所有患者海绵体内注射ADSC均耐受性良好，其中有8例患者重新恢复了勃起功能，国际勃起功能评分显著提高[25]。因此，通过病毒转导方式对ADSC进行相应的改造使之高表达某种因子及与相关新技术(如低能量冲击波)联合应用将是提高ED治疗效果的一个新方向，但ADSC对ED的治疗潜力仍需探究，相关临床试验有待进一步开展。

本文的研究方法和结论对于小药量爆炸驱动碎片飞散问题研究具有参考价值。然而，目前的理论计算不能反映数值模拟在装药质量比为0.657%～0.792%时，碎片速度出现跳跃变化的现象，其中的机制有待进一步研究。

2.4.1肾缺血再灌注损伤 肾移植是所有终末期肾病最有效的治疗方法[33]。缺血再灌注损伤通常为肾移植的并发症，分为冷缺血、热缺血和再灌注3个阶段，造成相关缺血性损伤和炎症反应爆发，引起移植物功能减退、无功能，急性排斥反应和间质纤维化等[34]。Zhou等[35]研究显示，向急性肾损伤大鼠肾实质内注射ADSC不仅能改善肾功能，减轻肾损伤，降低炎症因子的表达，同时还能促进多种生长因子分泌，从而促进缺氧/复氧损伤的肾小管上皮细胞的增殖和存活。Liu等[36]的研究发现，转染OX40-Ig融合蛋白的ADSC能更好地抑制移植肾肾小管中T细胞增殖，增加调节T细胞百分比，从而延长肾脏存活时间，减少肾脏排斥反应。有研究显示，ADSC能够明显降低缺血再灌注损伤大鼠肾脏的血肌酐、增加内生肌酐清除率以及减少氧化应激反应[37]。因此，ADSC的抗炎作用对免疫细胞的调节及氧化还原平衡和自由基的影响是今后治疗肾缺血再灌注损伤研究的热点。

2.4.2睾丸缺血再灌注损伤 睾丸扭转是指精索的扭曲或扭转导致睾丸的剧烈疼痛和缺血，首选的治疗方式为紧急手法复位和手术[38]。而ADSC用于睾丸缺血再灌注损伤的治疗是一种新颖且有效的治疗方式，一项关于ADSC对扭转引起睾丸损伤大鼠疗效的研究表明，脂肪血管间质含有大量的ADSC，将其注射到扭转的睾丸能明显促进成纤维细胞生长因子的分泌，降低氧化水平及减少激素的失衡，减轻组织学和细胞学损伤，表明ADSC对睾丸缺血再灌注损伤有保护作用[39]。Siregar等[40]研究了ADSC对于睾丸扭转后再灌注触发氧化应激产生活性氧类损伤的修复机制，结果发现经ADSC治疗的睾丸扭转组大鼠的丙二醛水平显著降低，表明ADSC睾丸内给药可以显著抑制睾丸扭转后睾丸组织缺血再灌注损伤后活性氧类的形成。可见，ADSC在睾丸缺血再灌注损伤中对氧化应激、活性氧类及自由基的产生具有重要影响，但仍需进一步深入研究。

2.3压力性尿失禁 压力性尿失禁的主要治疗方式包括电刺激治疗、药物治疗、盆底肌训练以及手术治疗[26]。而ADSC作为一种新颖的干细胞疗法，其用于压力性尿失禁治疗的相关研究也在逐渐增多。Cui等[27]对内括约肌障碍大鼠进行ADSC治疗后发现，大鼠排尿功能得到明显改善；细胞追踪实验显示，随着时间的延长移植后尿道括约肌和膀胱颈部细胞增加，肌球蛋白和α平滑肌肌动蛋白水平明显升高。另有研究表明，使用悬滴法制备的ADSC微组织注射到压力性尿失禁大鼠的尿道中，大鼠的排尿功能得到更好的恢复，可能与促进神经生长因子的释放相关[28]。这说明，ADSC可促进微环境中相关细胞因子的释放，这些细胞因子对其下游分子起到重要的调节作用。Ni等[29]研究发现，来自人ADSC分泌的外泌体可显著改善压力性尿失禁的排尿功能和促进组织的修复。表明ADSC可能通过其释放的外泌体与周围受损组织相互作用，从而起到治疗效果，但具体何种外泌体起作用尚需进一步探讨。Jalali等[30]向模拟尿失禁大鼠尿道中分别注射ADSC、肌肉来源的干细胞、ADSC与肌肉来源的干细胞混合物，结果发现与单纯注射ADSC或肌肉来源的干细胞组相比，注射两种类型细胞混合物组大鼠的尿道外括约肌发生了明显再生，尿道周围横纹肌明显增厚，尿道压力显著增加。提示将ADSC与其他类型的干细胞联合使用可能是进一步提高ADSC治疗效果的一种新方法。一项关于ADSC作用通路的研究显示，ADSC处理组大鼠的血管内皮生长因子和胞外信号调节激酶1/2表达水平明显升高，尿道周围血管明显增加，排尿功能得到明显恢复，这可能与促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶通路的激活以及胞外信号调节激酶1/2的磷酸化程度升高有关[31]。可见，在压力性尿失禁的治疗中ADSC分泌的外泌体种类、对逼尿肌细胞的作用、与其他类型干细胞的协同作用以及相关调节的分子与信号通路仍需进一步探究。尽管人工吊带悬吊术和人工括约肌的安全性和有效性已经得到证实[32],但无创的细胞疗法仍是未来的研究方向。

说来也有趣，1933年底，陈果夫被南京国民政府任命为江苏省政府主席。公事之余，他对江苏的饮食烹饪颇感兴趣，专门写了一篇《天下第一菜颂》：“是名天下第一菜，色声香味皆齐备，宴客原非专惠口，自应兼娱眼耳鼻。此菜滋补价不贵，可代燕耳或鱼翅。番茄锅巴鸡与虾，不独味甘更健胃。燥与湿兮动与植，中外水陆品类苹。勇能赴敌屈能伸，因物尤可激志气。我今郑重作宣传，每饭不忘愿同嗜。”对“平地一声雷”这道菜的食材、作法、营养、社会影响乃至于“励志作用”，都作了大肆的宣传，使得这道菜走出了江苏，走向了全国。

围绕人才培养的根本任务，作为大学教学管理职能实施与运行的主体——大学教学管理组织，对结构、人员、职权及运作等一系列内容进行组织、协调、控制，使之在教学活动中得到最充分的发挥，促使教学目标的最终实现。因此，从大学教学管理组织的机构来看，笔者较为赞同，大学教学管理是一个多层次的系统，在大学内部，涉及学校、学院、系、教研室等不同层次机构，不同层次的组织机构具有不同的管理职责与权利分工[3]。大学教学管理组织既是静态的专门性组织机构，又发挥动态的管理效能，是保证大学教学活动得以正常开展的基本条件。

2.4肾和睾丸缺血再灌注损伤

2.5泌尿系统肿瘤

2.5.1膀胱癌 手术和化疗是膀胱癌治疗的主要手段[41]。但接受根治性膀胱全切的患者相关生活质量受到影响，涉及排尿功能、性功能、经济、心理等[42]。Yu等[43]将膀胱癌EJ细胞和T24细胞与人ADSC共培养，结果表明加入ADSC的实验组T24细胞和EJ细胞的增殖和活力明显下降，形成的集落明显减少，迁移率和运动性明显降低，同时实验组的肿瘤细胞出现明显的凋亡，处于S期的细胞明显增多，提示ADSC可将肿瘤细胞周期阻滞在S期，而凋亡的实现则通过激活Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶，导致Bcl-2蛋白表达减少，Bcl-2相关X蛋白表达增加，可能与释放的可溶性因子触发人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/第一信使磷脂酰肌醇-3-激酶/第二信使蛋白激酶B信号通路调节，引起免疫抑制效应有关，但具体机制需进一步研究。同样，Wang等[44]也观察到将膀胱癌T24细胞、EJ细胞与人ADSC共培养，ADSC对T24细胞和EJ细胞的增殖有明显剂量依赖性抑制作用；细胞周期分析显示，T24细胞和EJ细胞出现S期阻滞，细胞周期蛋白依赖性激酶1表达下调，细胞周期蛋白A表达上调，同时T24细胞的凋亡增加，其机制可能涉及胱天蛋白酶3/7和Wnt/β联蛋白通路。上述研究均表明，阐明ADSC与膀胱癌细胞发生的相互作用及相互作用的具体通路至关重要。Maj等[45]分离了CD133阳性膀胱癌细胞并与ADSC共培养发现，ADSC分泌的细胞因子可以增加CD133+和CD133-亚群的增殖和活力，膀胱癌干细胞对ADSC分泌的分子信号也有强烈反应，提示ADSC旁分泌因子可能促进癌症的进展和转移。

2.5.2前列腺癌 前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一[46]。目前其主要诊断方法借助于前列腺特异性抗原值的筛查、前列腺穿刺活检等，治疗方法则包括主动监视、近距离放射疗法、雄激素剥夺疗法、前列腺癌根治术和多西他赛的化疗等[47]。Takahara等[48-49]进行了两项关于ADSC对前列腺癌细胞抑制作用的研究，结果表明ADSC的局部接种会延缓免疫缺陷小鼠体内种植肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋亡，这一途径极有可能通过转化生长因子-β信号转导通路实现；体外细胞实验和荷瘤裸鼠的体内实验均表明，ADSC能通过抑癌因子miR-145的旁分泌，抑制前列腺癌细胞的生长，诱导相应的细胞凋亡。Zolochevska等[50]用慢病毒载体转导修饰ADSC，通过色素上皮衍生因子作为治疗分子，研究修饰后的ADSC与前列腺癌细胞之间的相互作用，结果显示通过慢病毒载体转导的ADSC能够介导抑癌基因的表达，其中一部分与前列腺癌细胞表观遗传学的甲基化变化相关，同时ADSC-色素上皮衍生因子可以旁分泌方式促进前列腺癌细胞的重编程。这证明对ADSC进行不同的修饰，筛选出最合适的修饰来增强其功能十分必要。ADSC干细胞疗法在治疗前列腺癌方面具有独特优势，但其分子机制的相关基础研究较少，仍需进一步深入研究。

3 小 结

目前ADSC在泌尿外科领域的研究取得很大进展，但也存在作用机制研究不深入、临床试验较少的问题，今后需开展更加深入的基础研究、更大规模的临床试验及转化应用。未来，对于ADSC在泌尿外科方向的研究重点仍为其发挥作用的分子机制，尤其是与下游分子相互作用的信号通路，分泌的外泌体作用；其次与3D打印、低能量冲击波等新技术及一些新型材料的复合应用。相信随着ADSC作用分子机制的阐明并从基础研究向临床治疗积极转化，可为泌尿外科领域疾病的治疗提供新思路。