二肽基肽酶-4影响内皮细胞与血管生成机制的研究进展

陈钰洁，郑天鹏

(1.桂林医学院，广西 桂林 541199； 2.桂林医学院第二附属医院内分泌与代谢科，广西 桂林 541199)

糖尿病是一种常见的、以高血糖为特征的代谢性疾病，可导致多血管损伤。糖尿病血管病变是糖尿病最常见的并发症，也是2型糖尿病患者死亡的主要原因，50%新诊断的2型糖尿病患者已经有大血管病变，75%～80%的糖尿病患者死于血管病变[1]。血管内皮功能障碍在糖尿病血管病变的发展中起着关键作用[2]。糖尿病患者长期的高血糖、胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱、炎症以及氧化应激等均可导致血管内皮细胞损伤，最终导致血管内皮功能障碍；内皮细胞是排列在整个血管系统内表面的单层扁平鳞状细胞，通过释放多种活性介质调节血管舒张、凝血和炎症反应等功能[3]。而糖尿病血管内皮功能障碍的详细机制目前仍在研究中。二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase，DPP)4是一种蛋白酶，在调节胃肠源性肽激素的生物活性方面具有独特的作用，对炎症、免疫功能和细胞间信号转导有显著影响，对内分泌调节具有重要意义[4]。研究发现，可溶性DPP4能够直接参与内皮功能障碍或免疫调节[5]。有研究已经证明了DPP4抑制剂在2型糖尿病高血管并发症风险患者中的血管安全性[6]。同时，DPP4对血管内皮细胞和血管生成有一定的影响[7]。现就DPP4影响内皮细胞和血管生成机制的研究进展予以综述。

1 DPP4概述

1.1DPP4家族和功能 据报道，编码DPP4的人类基因定位于第2号染色体2q24.2位点[8]。DPP4是一个复杂基因家族的成员，其中几个成员非特异性地截断了许多与结构相关的肽，包括细胞因子、趋化因子、神经肽、激素和生长因子[9]。已知的DPP4蛋白酶家族主要包括成纤维细胞激活蛋白α、重组成纤维细胞激活蛋白α、DPP4、DPP8、DPP9、静止细胞脯氨酸二肽酶、乙酰聚合γ-谷氨酸羧肽酶、叶酸水解酶、前列腺特异性膜抗原以及胸腺特异性丝氨酸蛋白酶等[10]。

最初的研究发现，DPP4属于S9B蛋白质家族的丝氨酸外肽酶，由766个氨基酸组成，它可以裂解多肽N端的二肽，前提是残基末端倒数第二氨基酸是脯氨酸、羟基脯氨酸、脱氢脯氨酸或丙氨酸；DPP4广泛表达于细胞表面，发挥复杂的生物学作用，涉及细胞膜相关的细胞内信号转导激活、细胞-细胞间的相互作用以及通过DPP4的膜锚定和可溶性形式显示酶活性[9]。除了酶活性，DPP4的另一个重要功能是与一系列配体相互作用。有研究数据揭示了DPP4在细胞内信号转导、细胞凋亡、氧化应激产生、免疫激活以及胰岛素抵抗中发挥作用[11]。Wu等[12]证明，DPP9可被成纤维细胞活化蛋白通过非酶方式下调，促进人口腔鳞癌上皮-间充质转化。此外，有报道显示，DPP8和DPP9信使RNA在卵巢癌中表达较多，而DPP9在蛋白水平上表达较多[13]。这些活动赋予了DPP家族广泛的分子功能，对癌症和代谢性疾病的潜在病理作用具有临床意义。近年的前临床研究结果强调了DPP家族成员DPP4在血管内皮细胞生成中的作用[14]。

1.2DPP4的分布和生物学特性 DPP4是最有效的丝氨酸肽酶之一，在哺乳动物组织中广泛表达；DPP4表达于内皮细胞、内皮祖细胞以及一些重要的免疫细胞(如自然杀伤细胞、单核细胞、淋巴细胞、树突状细胞)和病理状态下的炎症细胞[9]。由于DPP4的广泛分布，使DPP4抑制剂成为一种在炎症调节[15]、造血恢复、免疫调节和内皮细胞生成[14]等方面很有前景的治疗药物。膜结合的DPP4通过与质膜上或细胞外基质中的相邻蛋白结合而具有催化活性和非催化活性。Chung等[16]的研究显示，跨膜区域负责主要的酶活性。除了跨膜结构域，以可溶性形式溶解在血浆中的从细胞膜上切割下来的肽的胞外结构域也显示酶活性[9]。

1.3DPP4与底物 DPP4通过调节丰富的底物发挥多种生理和药理作用，目前已经证实，抑制DPP4可以通过胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)途径促进胰岛素分泌，改善人体葡萄糖耐量[17]。也有研究表明，DPP4抑制剂可以改善无GLP-1受体小鼠的葡萄糖耐受性，提示DPP4具有独立于GLP-1的生物学作用[18]。此外，DPP4在体外截断了大量的肽激素和趋化因子，相对较少的肽已被鉴定为体内DPP4的内源性生理底物；已知许多细胞因子、趋化因子、激素和生长因子中存在公认的N端为丙氨酸或脯氨酸的DPP4截断位点，包括基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor，SDF)-1α、集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、白细胞介素-3、白细胞介素-1α、白细胞介素-6、高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein，HMGB1)、促血小板生成素以及白血病抑制因子等[9]。这些证据表明，DPP4通过降解和修饰这些血管内皮细胞生成相关因子调控新生血管内皮细胞生成的可能性很高。

2 DPP4在分子水平对内皮细胞及血管生成影响的机制

内皮细胞作为血管内环境的主要调节因子，除了通过维持血管的完整性使血管屏障功能保持完整外，还是许多生理过程的重要组成部分，如调节血管舒张和收缩、平衡出血和凝血以及协调炎症反应等[19]。当这些平衡系统被打破，发生内皮功能障碍时，内皮细胞转化为激活表型，从而进一步增强单核细胞和血小板的黏附以及促炎和促血栓形成因子的合成，加剧氧化应激，最终导致血管受损[4]。研究表明，DPP4抑制剂能够改善2型糖尿病患者和小鼠的内皮功能障碍[20]。DPP的个别家族成员可能参与了血管内皮细胞生成、血管疾病和癌症的发生。

2.1DPP4通过氧化应激影响内皮细胞与血管生成 DPP4涉及机体炎症反应，糖尿病患者胰岛素抵抗本身或高糖状态可促进DPP4的表达和释放。用DPP4抑制剂治疗载脂蛋白E基因剔除小鼠，不仅抑制了促炎因子白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达，也降低了循环炎症因子(如C反应蛋白、膜辅蛋白1、细胞间黏附分子-1)的循环水平[21]。而且抑制或沉默DPP4可降低衰老血管系统和衰老内皮细胞的内皮氧化应激水平，DPP4抑制剂可使AMP活化蛋白激酶α磷酸化和去乙酰化酶1表达[8]。氧化应激与炎症和糖尿病紧密相关，长期高血糖不仅会促进活性氧类的产生，还会削弱抗氧化系统，整体上导致氧化应激显著增加，一方面，氧化应激诱导脂蛋白和磷脂的氧化修饰；另一方面，氧化的四氢生物蝶呤可能导致内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)解偶联，从而进一步增强氧化应激，减少一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生；在内皮细胞线性模型中，DPP4增加了晚期糖基化终末产物诱导的活性氧类生成，增强了氧化应激[22]。因此，氧化应激在DPP4导致的内皮细胞损伤过程中发挥着重要作用，可能成为治疗血管创伤的潜在靶点。

2.2DPP4通过GLP-1影响内皮祖细胞与血管生成 在病理条件下，内皮祖细胞对修复内皮细胞起着重要作用，内皮祖细胞是内皮细胞的前体，可分化为能分泌各种调节介质的成熟内皮细胞[23]。骨髓源的内皮祖细胞向缺血结构归巢以增加新血管形成，在内皮损伤和缺血部位局部注射内皮祖细胞可加速大鼠血管和组织的修复[24]。糖尿病患者内皮祖细胞的数量显著低于健康人，而血管并发症患者的内皮功能与内皮祖细胞数量密切相关[25]。研究表明，DPP4可通过水解GLP-1导致内皮细胞功能障碍[26]。实验数据表明，使用GLP-1激动剂类的DPP4抑制剂治疗后内皮祖细胞数量增多[27]。这些发现说明，DPP4可以通过水解GLP-1抑制内皮祖细胞的动员和归巢。

脂联素是一种来源于脂肪细胞的脂肪因子，已被证明可以促进内皮细胞活化[28]。体内使用DPP4抑制剂可导致血浆脂联素水平显著升高[29]。Ishii等[7]证实，在缺血诱导的血运重建模型中，DPP4抑制剂显著增加了GLP-1和脂联素的表达，刺激内皮细胞网络形成；而在脂联素缺乏的小鼠中，DPP4抑制剂仅部分增加了缺血肢体肌肉的血流；GLP-1对血运重建的有益作用部分原因可能是升高了脂联素水平，表明DPP4的血管损伤能力可能部分依赖于GLP-1/脂联素机制。

2.3DPP4通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-A/eNOS信号通路抑制血管内皮细胞与血管生成 近年的研究表明，GLP-1类似物利拉格鲁肽在胰岛移植中通过诱导VEGF表现出促进血管生成的特性[30]。由此推测，DPP4可能通过介导GLP-1/VEGF通路在血管生成过程中发挥作用。另有报道显示，缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的表达可以通过激活VEGF和诱导eNOS影响内皮祖细胞，从而促进内皮细胞募集[31]。Marfella等[32]的试验和病理研究表明，在患有糖尿病足的患者中使用DPP4抑制剂维达列汀抑制DPP4，可使GLP-1水平升高，然后通过GLP-1调节的HIF-1α/VEGF通路减少氧化应激，利于血管生成和溃疡伤口愈合。Ishii等[7]在小鼠模型中发现，DPP4抑制剂维达列汀可以通过提高GLP-1水平促使内皮细胞网络形成，增加对照组小鼠缺血后肢的血流和毛细血管密度；更重要的是，维达列汀可不通过GLP-1促使人脐静脉内皮细胞分化为血管样结构。

DPP4介导的血管受损对缺血性应激反应的潜在分子机制包括：①药理DPP4催化活性通过肉瘤激酶依赖的eNOS/蛋白激酶B激活机制，促进缺血组织的血管受损；②DPP4在体内的血管损坏活性既与GLP-1的依赖性作用有关，也与GLP-1的非依赖性作用有关；③GLP-1对体内血管生成的有益作用部分通过维达列汀增加脂联素分泌的能力介导[7]。基于此，推测DPP4通过VEGF/肉瘤激酶依赖的eNOS/蛋白激酶B信号通路激活，而这种通路可能通过或不通过GLP-1依赖的机制。但DPP4与HIF-1α、eNOS、VEGF具体的相互作用目前尚不清楚，可能在血管生成过程的多个方面发挥重要作用。

2.4DPP4通过SDF-1刺激内皮祖细胞动员与血管生成 SDF-1是分子量为8 000的多肽，广泛表达于骨髓、心脏、肾脏、脑、脾、肝、胸腺和肌肉；且SDF-1是受损组织分泌的重要细胞因子之一，能吸引骨髓来源的内皮祖细胞，促进缺血心肌组织的血管生成；另外，SDF-1的受体——CXC趋化因子受体[chemokine(C-X-C motif) receptor，CXCR]4是一种7次跨膜G蛋白受体，在多种不同类型的细胞中广泛表达，如造血细胞、内皮细胞和基质细胞[33]。SDF-1/CXCR4通路参与调节内皮祖细胞的募集， 构成了血管修复的一个重要机制。DPP4不仅能够使缺乏氨基端的SDF-1失去趋化能力，而且还能干扰含氨基端SDF-1的趋化[34]。与野生型(DPP4+/+)小鼠相比，缺乏DPP4(DPP4-/-)小鼠循环中完整的SDF-1水平更高[6]，表明血浆中SDF-1水平受内源性DPP4活性的控制。Segers等[35]研究显示，重组SDF-1携带的突变对DPP4和基质金属蛋白酶的裂解具有抗性，可促进严重缺血后肢小鼠模型形成侧支动脉，并促进其血流恢复。针对DPP4活性的基因和药物干预在很大程度上增强了造血干细胞对SDF-1的趋化性，而抑制DPP4能够增强内皮祖细胞对SDF-1/CXCR4通路的依赖，使其向缺血血管归巢，从而促进血管生成[36]。因此，DPP4作为调节SDF-1活性的主要蛋白水解酶，可能通过依赖SDF-1的信号通路，成为干细胞治疗中促进血管生成的靶点。

临床观察发现，新生血管受损可能至少部分归因于炎症引起的骨髓衰竭和内皮祖细胞动员减少，而周围动脉疾病患者骨髓DPP4和基质金属蛋白酶9水平降低，DPP4与SDF-1/CXCR4通路相互作用也发生了改变[37]。Sun等[38]利用DPP4-/-大鼠模型检测DPP4在血管内皮细胞生成中的作用，结果得出相反的结论，即DPP4在维持血管功能和组织灌注方面起积极作用；在实验条件下，与年龄匹配的DPP4+/+大鼠相比，DPP4-/-大鼠内皮功能较差，循环内皮祖细胞数较少，对粒细胞-脑脊液和血管生成反应较差；而且缺血性手术后DPP4-/-大鼠骨髓与循环中的SDF-1α无浓度梯度，血液中其他SDF-1降解酶(如DPP8和DPP9)的代偿性增加。另一方面，Leu等[39]指出，虽然DPP4基因抑制可以恢复糖尿病缺血诱导因子的动员，但粒细胞集落刺激因子诱导的动员需要DPP4活性，而且DPP4在骨髓、外周血及靶组织不同的干细胞间室中的表达和活性不同。因此，通过对人类和DPP4基因动物干细胞的分析，可以发现由组织特异性DPP4失调所导致的糖尿病骨髓衰竭的机制。

2.5DPP4通过NO影响内皮细胞与血管生成 NO是机体中重要的内皮细胞源性舒张因子，是在L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的过程中以eNOS为催化剂合成的[40]。作为一个内皮细胞源性调节因子，NO在维持血管张力调节中起关键作用[19]，能够调节内皮细胞的增殖和凋亡，抑制血小板黏附和聚集，防止白细胞黏附和浸润[41]。因此，NO产生减少是内皮功能障碍的可靠指标[19]。DPP4抑制剂(如维达列汀、西他列汀)可能通过刺激eNOS激活和增加NO的产生对糖尿病大鼠/小鼠内皮功能发挥保护作用[42]。值得注意的是，内皮素-1是血管内皮细胞分泌的一种强效血管收缩剂，具有促炎和促有丝分裂作用，西他列汀在糖尿病大鼠的主动脉内皮抑制内皮素-1表达，可能通过激活AMP活化蛋白激酶和抑制核因子κB信号通路改善内皮功能[43]。

在病理条件下，内皮细胞表面黏附分子(如细胞间黏附分子、选择蛋白及血管黏附分子)和趋化因子(如单核细胞趋化蛋白1)表达增加，促进单核细胞与内皮细胞的黏附，刺激单核细胞向血管内皮细胞的跨内皮迁移并变为巨噬细胞[44]。研究发现，DPP4抑制剂可抑制血管黏附分子1、E-选择素、细胞间黏附分子1在内皮细胞的表达[22]，说明DPP4通过抑制AMP活化蛋白激酶依赖的核因子κB途径发挥强大的血管保护效应。

2.6DPP4通过HMGB1影响内皮细胞与血管生成 HMGB1是DPP4底物之一，具有DPP4裂解位点。HMGB1是一种高度保守的细胞因子，广泛分布于哺乳动物细胞内。在伤口愈合的新血管形成过程中，HMGB1在促进内皮祖细胞归巢和迁移中扮演重要角色。有研究表明，HMGB1通过促进胞外信号调节激酶1/2磷酸化，促进人脐静脉内皮细胞生长，提高血管生成活性，而利用DPP4预处理后胞外信号调节激酶1/2磷酸化显著降低，说明DPP4通过HMGB1-胞外信号调节激酶1/2信号通路影响内皮细胞，损害血管生成[45]。目前，DPP4损伤HMGB1血管生成功能的证据有限，但两者间的关系已经建立，有必要进一步的临床和基础研究。

2.7DPP4与神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)在血管生成中的作用 NPY是一种由下丘脑分泌的由36个氨基酸构成的多肽。据报道，NPY可以促进内皮细胞的增殖和迁移[46]。研究表明，NPY与DPP4共培养，DPP4将Tyr(1)-Pro(2)从NPY(1-36)上裂解下来，形成了具有促进血管生成作用的NPY(3-36)，而NPY(3-36)是一种非Y1受体激动剂(Y1受体是NPY受体的一种亚型)；而动脉粥样硬化组织微血管内皮中DPP4的表达可能改变NPY，使NPY对血管生成受体(Y2受体和Y5受体)具有亲和力，从而增强血管生成作用[47]，这种变化是动脉粥样硬化的病理表现。一项癌症生物学研究表明，缺氧可改变NPY活性，使依赖Y1受体和Y5受体的NPY细胞凋亡，激活Y2受体/Y5受体/DPP4/NPY(3-36)信号通路，可增强尤氏肉瘤干细胞的活性，促进血管生成[48]。因此，DPP4可能通过改变NPY活性促进血管生成。

NPY对血管生成反应非常重要，但也有学者提出相反的意见。例如，一项体外研究显示，尽管内皮细胞损伤刺激了DPP4的表达，但用单克隆抗体(E19和E26)阻断DPP4，可显著阻碍人类脐静脉内皮细胞迁移，NPY(1-36)可阻断创面愈合，而NPY(3-36)则具有血管生成作用，内皮功能障碍导致NPY升高，NPY通过增加炎症细胞的趋化性引发血管炎症[46]。这些发现表明，DPP4在血管生成过程中起相反的作用。DPP4与NPY相互作用、调控血管生成的具体机制仍需从血管生成相关的生理学和病理学角度进一步明确。

3 小 结

DPP4作为水解酶水解肠促胰岛素及其他底物，可与多种细胞因子结合，调节多种信号通路，导致内皮功能障碍，参与血管生成过程。DPP4 抑制剂除降糖作用外，在炎症性疾病以及糖尿病心血管并发症有中也有重要作用。因此，建立药物DPP4催化活性抑制相关的阴性和阳性血管生成作用下的分子生物学基础非常重要。未来关于DPP4机制的研究需要关注催化和非催化功能在2型糖尿病血管并发症中的相对作用，而临床试验将着重处理DPP4水平升高与2型糖尿病心血管并发症的相关性，并深入研究DPP4抑制剂在2型糖尿病心血管并发症中的有益作用。