癌变机制探讨

张 丰，蒋润民，张 超（肿瘤生物学国家重点实验室，空军军医大学西京医院病理科暨基础医学院病理学教研室，陕西 西安 700；空军军医大学唐都医院胸外科，陕西 西安 7008；中国人民解放军联勤保障部队第904医院泌尿外科，江苏 无锡 4000）

近年来，每年全球癌症患者新增发病1 800万，死亡960万[1]。我国每年癌症患者新增430万，死亡290万[2]。在我国，引起患者死亡最常见的癌症类型是肺癌、胃癌、食道癌、肝癌和结肠癌等[2]。20世纪30年代，Ewing[3]提出肿瘤是一种自主性过度增生的组织，1961年Willis[4]将肿瘤定义为一种生长和周围正常组织不一致、而且在缺乏诱发刺激时仍能存留和生长的肿块。虽然肿瘤被认为是一种细胞异常增生的疾病。但是，在临床实践中，区分肿瘤和非肿瘤主要依赖形态结构和含水量两个特点而不是增生指标。其中最常用也最准确的是形态结构特点，百年来病理学家根据肿瘤和正常组织细胞的形态结构差异，几乎可以100%诊断肿瘤[5]。近50年来，影像学家通过磁共振发现，肿瘤组织相比正常组织含水百分比增加，且越恶性的肿瘤，含水比例越高[6-9]。拉曼光谱（Raman spectroscopy）仪能精确地检测组织含水量，其可以99%敏感度区分癌与癌旁健康组织，被外科医生用来确定肿瘤边缘[10-12]。依据以上事实，我们推断形态结构和含水量异常背后可能隐含癌变机制的本质，但是，至今鲜有这方面的研究报道。

目前关于癌变机制仍存在争议和分歧[13-14]，主要存在基因突变（gene mutation）假说[15]、非整倍体（aneuploidy）假说[16]和组织场理论（tissue organization field theory）假说[13]。判断假说好坏不能只看假说自身的解释能力，更应重视假说的临床应用能力。除简要介绍以上假说外，结合本实验室研究与独立临床观察，我们还提出了另外一种全新的癌变机制假说。

1 目前流行的癌变机制假说

1.1 基因突变假说

大约一个世纪前，Hansemann等提出肿瘤是体细胞遗传物质发生“突变”的结果[16-17]。上世纪70～80年代，Varmus和Bishop在逆转录病毒和癌变关系的研究过程中发现原癌基因（protooncogene），提出癌基因（oncogeng）假说[18-20]。同期，Knudson[21]根据流行病学结果提出抑癌基因突变的“二次打击假说”，随后抑癌基因被发现并被克隆[22]。由于大部分致癌剂可以导致基因突变[23]，因此，基因突变积累的癌变假说（基因突变假说）被提出[24]。随后，该假说获得了大量的实验证据支持，典型的例子有：90年代初Fearon等[25]提出结肠癌多步癌变模式；1999年Weinberg实验室用三个不同的突变基因首次将人类健康细胞转变为癌细胞[26]；近二三十年来转基因和基因剔除动物癌变率升高，多基因突变导致动物恶性肿瘤发生率升高[27]；动物肿瘤细胞内癌基因信号被阻断可抑制癌细胞增殖[15,28]；近年来，针对癌基因突变的药物已应用于临床治疗，一些药物取得显著疗效，例如靶向BCR-ABL融合癌基因治疗慢性粒细胞白血病的格列卫。

虽然基因突变假说取得重大进展，但是该学说依然存在如下问题：①几乎所有实体肿瘤细胞都是非整倍体核型，即除了基因突变，肿瘤细胞总存在染色体结构和数目的改变[29-31]。②上世纪70～80年代，基因突变假说认为一个癌基因或抑癌基因改变就可以导致癌变[18,21]，也有人推测肿瘤发生需要3～7个基因突变[32]，至今，癌症基因组计划发现肿瘤细胞存在成百上千基因突变[33-34]，增加了癌症研究的复杂度和难度。③目前没有一个或一组突变基因可以用来区分癌与非癌细胞[13]，而且，即使同一类型肿瘤，不同个体的肿瘤突变也不一样[33,35]，导致分子诊断和靶向治疗趋向复杂化。④靶向突变基因的治疗只适用于一小部分癌症患者[33,36-38]。

1.2 非整倍体假说

100多年前，Boveri发现海胆卵子与两个精子形成的三倍体细胞在发育过程中丢失的某些染色体，形成的非整倍体海胆细胞形态上类似恶性肿瘤，因此Boveri提出非整倍体导致癌变的假说[16-17]。该假说在随后几十年没有引起研究人员的重视，直到上世纪90年代Duesberg等重新提出的非整倍体假说，认为癌变的主要原因是非整倍体导致细胞内正常基因表达比例失衡，而不是个别少数基因突变[30]。该假说的主要依据是：①几乎所有的实体肿瘤都是非整倍体核型[16-17,30,39]。②非整倍体不一定是基因突变的结果，因为端粒缩短核致癌因素都可直接导致非整倍体产生[40-41]。③非整倍体在癌前病变细胞就已经出现，非整倍体程度与肿瘤的恶性程度成正比[16]。④Duesberg等证实Weinberg实验室用三个突变基因体外制造的肿瘤细胞是非整倍体核型[26,30]。

非整倍体假说存在如下问题：①二倍体肿瘤是否还存在争议[31,42-44]。②非整倍体与癌变之间是否存在因果关系未能证明。③非整倍体在癌前病变和临床诊断方面具有价值，但至今没有开发出针对非整倍体的癌症治疗方法[45]。

1.3 组织结构场假说

早期研究人员发现化学方法诱发的肿瘤，如果停止使用促癌剂，相当一部分肿瘤会重新分化而自发消失[46]。Jaffe[47]发现卵巢细胞移植到脾脏可以自发癌变。King和McKinnell等[48-49]将青蛙的肾癌细胞核转移到正常卵细胞中，发现这种卵细胞依然可以发育成正常的蝌蚪。Mintz和Illmensee等[50-51]将畸胎瘤细胞移植至正常同系动物的胚泡内，结果产生不长肿瘤的嵌合型小鼠。Howell和Hurris等[52-53]发现肿瘤和正常细胞的融合细胞失去恶性表型。Gootwine等[54]将白血病细胞向同系动物的早期胚胎移植，发现白血病细胞可参与正常动物血液系统的发育，动物发育成熟后各系血液细胞均可发现白血病细胞的基因标记。McCullough等[55]将肝癌细胞向同系成年动物肝组织移植，发现癌细胞可参与正常肝脏细胞的更新；致癌剂作用于间质细胞却可以产生实质细胞肿瘤[56]，根据这些实验结果，Sonnenschein和Soto提出癌变的组织场理论（tissue organization field theory , TOFT）假说，该假说认为细胞的默认状态（default state）是增殖和移动，细胞间的相互作用可以限制细胞增殖和移动，细胞间相互作用的损坏导致细胞异常增殖、癌变和转移，该假说认为基因突变和非整倍体都是伴随现象[13,57-59]。

TOFT假说存在下列问题：①逆转肿瘤只是少数现象，需要苛刻的条件。②TOFT假说至今没有在癌症、预防、诊断或治疗方面提供有效的帮助。

2 癌变机制新假说——细胞内渗透压失控假说

理解增生的本质，是深入理解癌变机制的基础。细胞增生的动力来自哪里？长期以来，该问题很少受到研究人员的重视。传统观点认为生长因子、细胞内原癌基因和细胞周期调节基因激活促进细胞增生[15]，但是，生长因子、原癌基因和细胞周期调节基因显然不是细胞增生的动力，最可能只是细胞增生的调节因子。

2.1 哺乳动物细胞内外渗透压并不相等

细胞膜为脂质双分子层，具有半透膜的特性，水分子可以自由通过，而离子和有机大分子不可以自由通过[60-61]。细胞内的离子和有机大分子的摩尔浓度一般大于细胞周围环境中这些物质的摩尔浓度，因此细胞内的渗透压一般大于细胞外的渗透压。实际上，细菌、真菌和植物细胞内的渗透压常常达到3～7个大气压水平[62-64]。虽然传统观点认为哺乳动物细胞内外渗透压相等，但是，一些常见的现象提示我们，哺乳动物细胞内外的渗透压并不天然相等，比如，短时间缺血缺氧，细胞会水肿胀大；稍长时间，细胞会肿胀坏死。因此，哺乳动物细胞内外渗透压并不相等，我们习惯性认为细胞内外渗透压相等其实是细胞对细胞内外渗透压调节的结果，一旦调节机制失灵，细胞可能很快被胀破死亡。

2.2 细胞分裂的动力来自细胞内渗透压

细菌、真菌和植物细胞依赖细胞壁对抗细胞内渗透压，哺乳动物细胞主要依赖细胞骨架和钠钾泵控制细胞内渗透压。细胞骨架主要由微管、微丝和中间丝构成，其中微丝和钠钾泵对于细胞内渗透压调节具有重要作用[65-66]，由于微丝和钠钾泵工作需要消耗大量ATP[65,67-68]，体外实验表明细胞产生的能量20%～70%被微丝和钠钾泵消耗[67-68]，因此，哺乳动物控制细胞内渗透压需要消耗大量的能量。为了补充能量消耗，细胞需要从环境中吸收糖、脂肪和蛋白质等营养物质，营养物质进入细胞会引起细胞内渗透压增加和细胞体积增大，细胞体积超出细胞骨架构建最大结构极限的时候，局部受力最大部位的细胞骨架可能因“损伤”而过度修复和重构，形成收缩环（contractile ring），收缩环克服细胞内渗透压，将细胞一分为二，完成细胞分裂。因此，本文认为细胞增生的动力来自细胞内渗透压，细胞周期性分裂的目的在于周期性地降低细胞内渗透压，地球上各种生命的细胞其实只是水“吹起的泡泡”而已[69]。

很多自然现象和实验证据支持细胞内渗透压是细胞分裂的动力。地球上水多的地方，生命繁茂，而水少的地方，生命稀少。人胚胎细胞含水量达到90%，儿童细胞含水量可达80%，成年人细胞含水量约70%，老年人细胞含水量约60%[70-71]。具有分裂能力的皮肤细胞居于基底层或真皮层的毛囊部位，皮肤表层细胞容易脱水失去增生能力而分化和角化[72]。间充质干细胞向软骨细胞分化时，软骨细胞首先发生在距离血管最远的间充质干细胞核心聚集的无血管区[73]。在动物体内，干细胞一般聚集在毛细血管周围，而分化的细胞远离血管[74]。上述现象提示细胞含水量下降，细胞增生速度下降或分化。细菌、真菌和植物细胞都先体积胀大才开始DNA复制和细胞分裂，而胀大的力量来自渗透压[62,64,75-77]。哺乳动物细胞分裂过程中体积首先会不断增大，该过程依然依赖渗透压[65,78-79]。没有渗透压引起的向外的胀力，细胞核会因为细胞骨架和核基质而回缩，比如，早期凋亡的细胞表现为细胞核固缩。由于真核细胞的核内空间有限，细胞核致密且具有很强的韧性，如果没有多余的空间，DNA无法复制[80-83]，因此，渗透压推动细胞体积胀大的同时，通过细胞骨架牵拉细胞核膜，促进细胞核体积增大，为DNA复制提供空间，促进DNA复制。类似道理，牵拉皮肤促进细胞分裂，可用于扩大植皮面积[84-85]。体外细胞培养实验表明，低渗环境促进细胞增殖[86]，但是高渗环境不但抑制细胞增殖[87]而且促进细胞分化或凋亡[72,88-90]。原子力显微镜实验证实细胞分裂时细胞内压力不断增大，从G1期开始上升，到M期时到达最高点，随着细胞分裂，压力迅速下降[65]。Huang等[91]将M期的细胞浸泡在低渗溶液中，正在分裂的细胞迅速退出M期，再次把退出M期的细胞放回等渗溶液，细胞又重新进入M期，并最终完成细胞分裂过程，该实验证明M期细胞分裂需要克服细胞内的渗透压。M期细胞分裂依赖收缩环的收缩力克服细胞内的渗透压，收缩环主要由微丝和肌动蛋白构成[92]，细胞松弛素可以抑制微丝组装，其处理细胞可以导致细胞收缩环组装异常而无法分裂，产生双核或多核巨细胞[93]。低渗应激可迅速激活生长因子（EGFP等）和原癌基因（Src和Ras等）信号通路[94-95]。以上事实均支持细胞分裂动力来自细胞内渗透压。

如果细胞内渗透压是细胞分裂的动力，那么调节细胞内渗透压可以改变细胞分裂速度。哺乳动物细胞内的渗透压调节主要依赖细胞骨架和钠钾泵。大量实验表明生长因子（EGFP等）和原癌基因（Src和Ras等）信号在G1期抑制微丝组装，导致细胞对抗细胞内渗透压的力量下降，水进入细胞，细胞体积增大15%～30%左右，细胞内的大分子被稀释，合成代谢激活，细胞进入S期[96-97]，但是在M期癌基因信号（Ras等）又促进微丝重构和细胞分裂[92,98]，因此，生长因子和原癌基因信号可通过调节细胞骨架变构从而调节细胞分裂。除了细胞骨架，钠钾泵对于细胞内渗透压的调节也具有重要作用，钠钾泵每次排出3个钠离子和2个钾离子以降低细胞内的离子渗透压，从而降低细胞内整体渗透压。细胞静息膜电位的产生源于钠钾泵工作导致细胞内外离子浓度差异，静息膜电位的高低可以间接反映钠钾泵的功能。有研究表明经常处于分裂状态不稳定细胞的静息膜电位较低（10～30 mV），而不经常分裂的稳定细胞（肝细胞等）的静息膜电位中等（40～50 mV），永久性不分裂的细胞（神经元和肌肉细胞）的静息膜电位最高（70～90 mV）[99-100]。神经元和肌肉细胞的静息膜电位最高，说明钠钾泵对这些细胞的渗透压调节最强，所以这些细胞不再增殖。与该推测一致，用哇巴因抑制钠钾泵，升高细胞内渗透压，神经元细胞竟然开始DNA复制[101]。

2.3 细胞内渗透压失控导致癌变发生

调控细胞内渗透压可以调节细胞分裂速度。如果细胞过度控制细胞内的渗透压，细胞可能分化或衰老；如果控制机制损坏，不能有效控制细胞内渗透压的升高速度，细胞可能异常增生和癌变。因此，我们认为癌变是细胞内渗透压失控的结果[69,102-103]。

2.3.1 肿瘤细胞内含水量增加肿瘤细胞的细胞骨架损坏[5,104-120]和钠钾泵功能下降[99,121-125]，对抗肿瘤细胞内渗透压的能力下降，会导致更多的水进入细胞内。事实上，几十年来磁共振反复证实肿瘤组织含水百分比增加，而且越恶性的肿瘤，含水比例越高[6-9]。近年来利用拉曼光谱仪再次证明肿瘤组织含水量增加[10-12]。

2.3.2 肿瘤细胞的细胞骨架异常临床上病理学家一直根据肿瘤和正常组织细胞的形态结构差异诊断肿瘤[5]，组织和细胞的形态结构主要由细胞骨架决定，研究发现肿瘤细胞的细胞骨架明显异常。首先，肿瘤细胞分化障碍，细胞分化主要与细胞骨架中间丝表达有关，中间丝包括角蛋白和神经纤维等。癌细胞分化障碍说明中间丝表达异常，典型的例子有化学诱导皮肤癌变后，癌细胞不再表达皮肤终末分化标志角蛋白K10和K1[104]。而且，角蛋白突变导致皮肤上皮细胞耐受低渗应激能力下降[126]。其次，微丝而不是微管主要参与细胞内渗透压调节[65,127]，研究发现癌细胞的微丝组装明显异常，而且异常程度与恶性程度成正比[105-117]。最后，大量实验表明癌基因Src和Ras等蛋白产物可以直接抑制微丝的组装，降低细胞骨架微丝对抗细胞内渗透压的能力[118-120]。

2.3.3 肿瘤细胞钠钾泵功能异常事实上，肿瘤细胞的静息膜电位低于正常细胞[99,121-123]，而且多方研究表明，肿瘤细胞内的钠浓度高于正常细胞2～5倍[123-125]，这些均提示肿瘤细胞的钠钾泵功能下降。

2.3.4 癌细胞存在大量基因突变和非整倍体细胞控制渗透压的目的是协调DNA复制与细胞分裂之间的关系。癌变因素导致细胞对抗细胞内渗透压能力下降，引起细胞提前分裂，导致DNA提前复制，甚至在没有修复或合成完成时就发生分配，引发基因组不稳定，基因突变率升高，核型非整倍体化。事实上，大量研究表明肿瘤细胞内DNA复制起始位点显著增多，明显处于提前启动DNA复制的状态[128-132]，而且癌症基因组测序和核型分析证明癌细胞拥有大量的基因突变和异常核型（非整倍体）[16-17,30,33-34,39]。

2.3.5 非整倍体具有促癌作用非整倍体与癌变的关系一直存在争议，比如，非整倍体假说认为非整倍体促进癌变[30]，但是基因突变和TOFT假说认为非整倍体只是伴随现象[13,15]。本文认为非整倍体在同等时间内不但产生更多的RNA和蛋白质，甚至产生很多无用的RNA和蛋白质分子，因此，在相同的时间内，非整倍体导致肿瘤细胞比正常细胞渗透压升高速度更快，从而提前启动细胞分裂和DNA复制过程[69]，该推测得到最近的实验支持[133]。

2.3.6 恶性肿瘤组织中，双核或多核瘤巨细胞增多事实上，在临床病理诊断中经常看到随着肿瘤恶性度升高，双核或多核瘤巨细胞比例增多，典型的例子有胶质瘤和肾癌[134-136]。这是由于渗透压推动细胞走向分裂，但是细胞要一分为二，还需要微丝收缩环对抗细胞内渗透压[91,137]，将细胞一分为二[91]。由于肿瘤细胞微丝异常，而且，越恶性的肿瘤，微丝功能受损越严重[105-112]，导致部分肿瘤细胞的微丝收缩环不能对抗肿瘤细胞内的渗透压，引起细胞无法分裂，双核和多核瘤巨细胞比列增加。

2.3.7 恶性肿瘤发生去分化恶性肿瘤存在去分化现象[5]，但是机制不清楚。刘劲松[5,135]认为恶性肿瘤去分化是癌变初期多倍体瘤细胞通过“巨细胞周期”引起基因组重编程的结果。我们认为恶性肿瘤去分化是肿瘤细胞对抗细胞内渗透压能力下降，导致渗透压引起向外的胀力通过细胞骨架拉伸细胞核，引起细胞核重编程的结果，支持该假说的实验证据有低渗应激可以改变细胞核结构、染色质状态、表观遗传修饰以及基因表达改变，促进细胞逆分化或转分化[138-143]。

2.3.8 肿瘤侵袭与转移恶性肿瘤具有侵袭和转移的能力，但是基因测序没有发现专职负责侵袭和转移的突变基因[33,37]。按照TOFT假说，单细胞默认状态是增殖和移动，细胞之间的黏附丧失导致癌变和转移，但是，TOFT假说不能合理解释黏附丧失的机制[13]。其实，在低渗状液体中黏附细胞最大的表现就是在几分钟之内失去黏附贴壁能力而变圆，最后胀破死亡，因此，低渗应激能迅速破坏细胞的黏附能力。由于恶性肿瘤的细胞内渗透压控制机制损坏，导致其对抗细胞内渗透压能力下降，过多的水进入细胞，引起类似低渗应激状态，从而失去黏附能力，因此，恶性肿瘤获得侵袭和转移能力。

2.3.9 在低渗环境下肿瘤细胞比正常细胞更脆弱在低渗环境下肿瘤细胞比正常细胞更脆弱，而且越恶性的肿瘤越脆弱。事实上，脆性实验检测发现来自白血病患者的白细胞比正常白细胞脆性更大[144-145]。虽然目前很少有人直接比较实体肿瘤细胞与正常细胞对低渗的耐受情况，但是手术后应用蒸馏水灌洗胸腔和腹腔，能明显降低肿瘤的播散转移，提高患者生存率[146-147]。小鼠腹腔接种胃癌后，采用腹腔注射蒸馏水方式比注射生理盐水明显提高小鼠生存时间[148]。

2.3.10 靶向渗透压调控分子可以治疗恶性肿瘤青霉素通过抑制细胞壁合成，借助细菌内强大的渗透压杀死细菌[62,149]，笔者认为类似方法也可用于恶性肿瘤治疗。相比正常细胞，肿瘤细胞对抗细胞内渗透压的能力下降，而且，越恶性的肿瘤，对抗细胞内渗透压的能力越差。由于抑制钠钾泵可快速升高细胞内渗透压，因此钠钾泵具有抗肿瘤特性。事实上，近年来多次抗肿瘤药物筛选实验证明地高辛等具有明显的抗肿瘤作用[150-152]。抑制细胞骨架可降低细胞对抗细胞内渗透压的能力，因此细胞骨架抑制剂具有强大的抗肿瘤作用，实际上，多种细胞骨架抑制剂已在临床应用多年[153-162]。最后，我们推测，钠钾泵和细胞骨架（特别是微丝）抑制剂组合可能具有协同杀死肿瘤细胞的能力，而且，新的细胞渗透压调节分子可能成为广谱治疗恶性肿瘤的新靶点。

3 结语

本文简要介绍了目前流行的癌变机制假说。虽然基因突变假说已经被大部分研究人员接受，该假说指引的方向已经在癌症预防、诊断和治疗方面取得了重要进展，但是，由于基因突变假说指引的方向趋于复杂化，是否有更简单的方法用于癌症治疗是我们目前面临的一个重要课题。非整倍体假说和TOFT假说虽然可以解释很多癌变现象，但是这两个假说所指引的方向没能提供癌症治疗新方法。我们实验室提出细胞内渗透压失控假说，认为细胞内渗透压失控将导致癌变发生，治疗癌症应该采取类似青霉素杀死细菌的方法，也就是借助细胞内的渗透压杀死肿瘤细胞，并认为越恶性的肿瘤，越容易被渗透压调节方法杀死，该方法不再考虑恶性肿瘤基因突变的异质性，因此可能成为一种简单和广谱的癌症治疗方法。