温泉水中嗜肺军团菌污染调查及分子分型研究

章乐怡,李 毅,上官智慧,吴跃进,谢爱蓉,王良怀,陈文斌

温泉水中嗜肺军团菌污染调查及分子分型研究

章乐怡1,李 毅1,上官智慧1,吴跃进1,谢爱蓉1,王良怀1,陈文斌2

目的 探讨温泉水环境中嗜肺军团菌的污染状况和分布规律，了解其主要血清型别及基因型别。方法采取随机抽样方法采集温泉场所蓄水池、温泉池、客房淋浴水等，浓缩后用细菌培养法分离得到可疑菌株，用血清学与荧光定量 PCR技术进行嗜肺军团菌的鉴定。对分离的菌株用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型方法(SBT)进行基因分型。结果65份温泉水中35份检出嗜肺军团菌，检出率为53.85%。嗜肺军团菌计数范围在20 CFU/100 mL-16 000 CFU/100 mL之间。血清分型以LP1、LP3为主。分离的嗜肺军团菌菌株均携带dot基因。对40株嗜肺军团菌菌株进行了PFGE聚类分析，得到10种不同的带型。40株菌株13种ST型可以被分为3个克隆群和1个单态群。结论本地区温泉水嗜肺军团菌污染程度较高，分子分型结果表明这些菌株具有遗传多样性。

温泉水；嗜肺军团菌；分子分型；遗传多样性

Supported by the Science and Technology Development Program of Wenzhou City(No.Y20150311)

军团菌(Legionella)是一种革兰阴性杆菌,广泛存在于自然环境和人工环境的水体、土壤中。军团菌病是由军团菌引起的一种以肺炎为主的全身性疾病。嗜肺军团菌是导致军团病最主要的病原体。人类对军团菌普遍易感，人感染军团菌主要是通过吸入被军团菌污染的气溶胶而导致[1]。我国于1982年在南京首次发现军团菌病病例，全国已有多起军团病的散发与暴发、流行报道[2-4]。

近年来国外温泉水引起的军团菌暴发事件时有报道，旅游获得型疫情中，以源于温泉与水疗的比例最高。欧洲军团菌感染工作组(EWGLI)2007—2008 年间报告军团菌疫情中，其中 6 起与喷泉和水疗有关[5]。日本也有相关文献报道军团菌病例发生与温泉水有关[6]。

国内陆续有来自各地对环境样本军团菌监测报道，大多是来自集中空调冷却塔水、冷凝水的调查[7-8]，也有淋浴水、管道水、温泉水、花卉培育土等军团菌污染调查[9-10]。环境监测结果表明军团菌已成为人们日常生活中威胁健康的重要因素。在温州地区，对于冷却塔水监测是从2009年开始的，但是对于温泉水系统的监测处于空白。温泉风景区是我市的旅游胜地，近些年温泉文化主题景区的开发力度较大, 吸引不少省内外游客。因此为保证游客健康，在本地区进行温泉水环境军团菌污染调查是有必要的。我们选取本市温泉景区4个温泉场所作为监测点，进行嗜肺军团菌的调查和研究, 对分离出来的菌株用脉冲肠凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(SBT)进行分子分型研究。

1 材料与方法

1.1样本采集 采集本市温泉风景区 4家温泉场所(包括温泉酒店和度假村)的温泉水，在正常营业期间于每个场所采水样，分别在2015年8月、2016年1月、2016年6月3个时间段进行，前两次采样，每次每家场所随机选取5个点，包括各个温泉池水和房间淋浴喷头的温泉水。2016年6月除采集温泉池水和房间淋浴喷头的温泉水外，增加采集温泉泉眼水、各个温泉场所的蓄水池水，以灭菌广口瓶采集水样500 mL，并记录水温，水样加硫代硫酸钠中和余氯，当日送达实验室进行检测。

1.2军团菌分离 参照文献[11]进行军团菌分离，取200 mL水样，用孔径0.45 μm 滤膜经抽滤系统集菌后进行酸处理，取0.1 mL 处理过的样品接种于GVPC平板，置于5% CO2培养箱中，37 ℃孵育10 d，逐日观察结果，挑取可疑菌落做初步鉴定。在 BCYE 平板上生长而在BCYE-cye 平板及血琼脂平板上不生长的初步认定为军团菌，疑似菌落再进行血清学凝集试验。

1.3荧光定量PCR方法 参照文献[12-14]的引物和探针，针对军团菌属5S rRNA 基因和嗜肺军团菌dot基因保守序列，5S rRNA 探针5′端标记HEX，3′端标记BHQ；dot基因探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。通过检测这2种基因进一步进行菌株复核鉴定。

1.5SBT分型 利用7个基因测序对军团菌进行SBT分型。选用7种管家基因合成7对引物，选择嗜肺军团菌的7个基因(flaA,pilE,asd,mip,mompS,proAandneuA)作为本研究的目的基因。等位基因的选择参照EWGLI网站发布的嗜肺军团菌SBT 标准方法(5.0版本)http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php。运用BioNumerics version 7.5 对所得嗜肺军团菌ST型别进行聚类分析，分析其遗传关系。

1.6统计学分析 采用SPSS19.0软件进行数据统计分析，以率、构成比为主要指标，率的差异比较用χ2检验，P<0.05 差异有统计学意义。

2 结 果

2.1温泉水中嗜肺军团菌检出情况 共检测温泉水65份，35 份检出，检出率为53.85%；夏季检出率为51.11%(23/45)，冬季检出率为60%(12/20)，夏季、冬季检出率无统计学差异，(χ2=0.44，P>0.05)。嗜肺军团菌计数从在 20 CFU/100 mL～16 000 CFU/100 mL之间。其中军团菌含量为10～100 CFU/100 mL)者有18份标本 ，军团菌含量为100～1 000 CFU/100 mL者有 11 份标本 ，军团菌含量1 000～10 000 CFU/100 mL者有4份标本，2份标本军团菌含量>10 000 CFU/100 mL。温泉泉眼没有检出嗜肺军团菌，温泉池、蓄水池、房间淋浴喷头的温泉水检出率分别是83.33%、42.86%、36.36%。(χ2=12.814，P<0.05)见表1。

表1 温泉场所不同温泉点温泉水嗜肺军团菌检出情况

Tab.1 Contamination status of hot spring water from different collecting points

采集地点Samplinglocation阳性率(%)Positiverate(%)蓄水池watertank42．86(3/7)温泉池hotspringpool83．33(20/24)淋浴喷头shower36．36(12/33)泉眼spring0(0/1)合计Total53．85%(35/65)

2.2嗜肺军团菌血清型分布情况 从35份军团菌阳性的水体中共检出40株嗜肺军团菌菌株(有5份水样分别检出2个型别的嗜肺军团菌)。其中包含LP1、LP2、LP3、LP13等4种血清型，LP1占检出菌的37.50%(15/40)、LP3 为45.00%(18/40)，LP2为12.50 %(5/40)，LP13为 5.00%(2/40)。

2.3荧光定量PCR结果 利用军团菌5S rRNA基因和嗜肺军团菌dot基因的引物，对40株检出的军团菌菌株进行 PCR 扩增，结果40株军团菌5S rRNA、dot基因均为阳性，阳性率为100.00%，5S rRNA是军团菌属共有基因,高度保守，dot基因来区别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌，dot基因作为嗜肺军团菌一种毒力岛基因，与毒力有关，结果证明40株菌株均为嗜肺军团菌。

2.4PFGE结果 对40株分离株进行了PFGE分型，获得10种不同的带型，以 LPA16.CN0142 带型最常见，共13株。温泉水中带型一致的有来自不同的温泉场所，且同一温泉中有多种带型。见图1。

A代表温泉池，B代表客房淋浴喷头，C代表蓄水池，HW1-4表示4个温泉场所A：hot spring pool, B：shower room, C：water tank, HW1-4 four hot springs environments图1 2015-2016年温泉场所中分离出的40株嗜肺军团菌PFGE聚类结果 Fig.1 Clustering results of patterns obtained by PFGE analysis of 40 Legionella strains from hot springs in 2015-2016

2.5SBT分型结果 通过BioNumerics 聚类分析， 40株嗜肺军团菌菌株ST型被分为 3 个克隆群和 1个单态群，其中克隆群1 包含 8种ST 型，克隆群2、3 均包括2种ST型。40株菌株分为13种ST型，分别有ST 87、1226、1230、1469，1101等。几种嗜肺军团菌血清型的 ST型别：15株LP1血清型军团菌被分为7种 ST型，11株LP3 血清型被分为5种ST型，5株LP2血清型分5种ST型。温泉水中发现几种新的ST型，与本地区其他水中分离菌株相比，温泉水分离菌株具有更高的多态性，其中ST87比较常见，在3个温泉中都发现。见表2、图2。

表2 温泉水中不同血清型嗜肺军团菌的克隆群分布

Tab.2 Distribution of clonal groups from 40 SBT profiles for different serotypes of L. pneumpphila isolated in springs

Clonalgroups(CGs)STsserogroupsflaApilEasdmipmompsproAneuANo．ofisolatesCGl(n=21)1469LP3261739111131101LP1661539141122196LP1，LP2，LP13661534141142198LP2610157174312201LP11761539141112203LP1，LP36615394362204LP1，LP366153441332205LP217101571714111CG2(n=14)87LP321032894138961LP1，LP3210328914116CG3(n=2)2197LP235171411812199LP27517143281Singleton(n=3)2202LP12101714211483

最小生成树的圆圈表示序列类型，每个圆圈的大小表示在这个ST型别的分离株数量, ST周围的光环的颜色表示同一克隆复合物群。

In the minimum spanning tree, the sequence types (STs) are displayed as circles. The size of each circle indicates the number of isolates within this particular type, the colors of halo surrounding the STs denote types that belong to the same clonal group.

图2 温泉水中40株嗜肺军团菌最小生成树图

Fig.2 Minimum spanning tree analysis of 40Legionellaisolated from spring water

3 讨 论

本研究表明本市温泉水嗜肺军团菌检出情况不容乐观，分别于3个时间段进行采样，前两次是随机采取各温泉场所的温泉池及房间淋浴喷头温泉水。检测结果表明嗜肺军团菌检出率一直居高不下，最后一次进行污染源的调查，从温泉泉眼着手，采集泉眼水、每个温泉场所的蓄水池、温泉池及房间的淋浴喷头温泉水。4个温泉场所温泉水来自同一温泉泉眼，结果表明温泉泉眼水未检出嗜肺军团菌，3个温泉场所的蓄水池均检出嗜肺军团菌，而温泉池及客房淋浴的温泉水都是分别从各场所蓄水池通过管道流入的。温泉池及客房淋浴水检出的嗜肺军团菌的血清型别较蓄水池多，部分检出和蓄水池相同的型别。蓄水池中均只检出一种型别的嗜肺军团菌，不排除其他血清型漏检的可能，部分温泉池中检出两种以上的嗜肺军团菌，这和别的文献中报道也是相符的[10]。温泉水检出的嗜肺军团菌中以LP1型和LP3型为多，LP1和LP3型是引起军团菌病的两个主要的血清型。

温泉水嗜肺军团菌计数表明有6份温泉水嗜肺军团菌计数超过1 000 CFU/100 mL ，其中2份高于10 000 CFU/100 mL。根据文献，在欧洲一些国家，当水体中嗜肺军团菌数量>100 CFU/100 mL时，就必须对这种水体进行消毒处理[17]。虽然到目前为止，对军团菌感染剂量还没有精确的定义，但数据表明，在军团菌水污染达102-104CFU/100 mL时，可能会导致散发病例，当数值超过104CFU /100 mL可能会引起军团菌暴发[18-20]。而我们的温泉水计数最高的2份水样中的嗜肺军团菌几乎到达文献中军团菌病暴发的一个值。虽然目前在中国2011年旅游行业标准《温泉企业服务质量等级划分与评定》LB/T 016-2011[21]里规定温泉水不得检出嗜肺军团菌，但没有定量限值，且没有标准检验方法，表明温泉水行业标准有待进一步完善。

PFGE结果表明，几个温泉场所的的温泉水各自的军团菌PFGE带型多样化，但大多数菌株相似度达87.0%以上，同一温泉场所中不同地点的温泉水有几种带型存在。温泉场所1的蓄水池与温泉池中菌株血清型不同，但PFGE分析菌株相似度达 94.1%；温泉场所3的蓄水池与部分房间淋浴水、温泉池检出的菌株带型一致，但部分血清型不一致；温泉场所4的蓄水池与部分温泉池检出的菌株带型一致。说明这些菌株是相关联的。由于温泉蓄水池没定期清洗，嗜肺军团菌一直在池水中存活，并流到了各个温泉池，而在不同的环境中，部分菌株某些位点发生了变异。温泉场所2中的蓄水池没有检出，但在不同的房间淋浴喷头水里检出嗜肺军团菌，各个点分离出的菌株，有完全一致的带型，也有相似值较低的。故PFGE分型进一步证实各场所温泉水嗜肺军团菌污染的环节是不同的。除了蓄水池这个污染环节外，还存在某些温泉池或淋浴管道本身污染的可能。而单纯的血清分型不能说明军团菌污染来源。

温度被认为是主要影响军团菌污染的因素[22]。我们在每份水样采样时均做了水温记录，发现4个温泉点的水温在32 ℃～41 ℃，正是嗜肺军团菌繁殖和存活的适宜温度。文献报道，通常嗜肺军团菌的最适生长温度在35 ℃和46 ℃之间[23]。

嗜肺军团菌 SBT分型结果表明本地区温泉水中的嗜肺军团菌具有遗传多样性，共分为13种ST型。分离到9种新的ST型(ST2196-2205)，是欧洲数据库中没有的ST型，成为目前本地区嗜肺军团菌的特有型别，另4个ST型(ST87，ST7、ST114、ST9)以前均在世界多个国家引起军团菌病，特别需关注ST87，在3个温泉场所均发现，血清型为LP3，与欧洲军团菌数据库中提交的临床株血清型一致。温泉水菌株中没有发现ST1型，而本地区历年冷却塔水中检出的 ST型以ST1型为主，且血清型均是LP1[24]。故遗传进化分析表明本地区温泉水中嗜肺军团菌的遗传特征有别于冷却水中的嗜肺军团菌。

结果表明温泉水嗜肺军团菌污染程度较高，有个别点已达到一个高风险的值，故对人群的健康存在潜在风险，为保护广大旅游者的健康，预防和控制本市军团菌病的发生，应该对这些温泉度假村进行必要的干预。

调查研究结果向卫生部门提交后，相关部门对温泉场所进行了专项整治，规范温泉的卫生管理，进行彻底清洗消毒，并制定日常消毒管理制度。

(此项研究得到中国疾病预防控制中心传染病预防控制所秦天老师、周海健老师、任红宇老师等几位专家的大力支持和帮助，在此一并致谢！)

[1] Blatt SP, Parkinson MD, Pace E, et al. Nosocomial legionnaires' disease: aspiration as a primary mode of disease acquisition[J]. Am J Med, 1993, 95(1): 16-22. DOI: 10.1016/0002-9343(93)90227-G

[2] Ma XY, Wang YQ, Peng XM, et al. Investigation of an legionnaires' disease outbreak associated with contaminated air - conditioning system[J]. Chin J Epidemiol, 1998, 19(4): 200-205. DOI: 10.3760/j.issn:0254-6450.1998.04.002 (in Chinese)

马小燕，王玉琴，彭晓旻，等. 一起空调系统导致上呼吸道感染样军团病暴发的调查[J]. 中华流行病学杂志，1998，19(4):200-205.

[3] Deng CY, Fang XS, Wang CQ, et al. Investigation on an outbreak of Legionnaires'disease caused by Lboz in a suburb of Beijing[J]. Chin J Epidemiol, 2001, 22(3): 182-183. (in Chinese)

邓长英，房兴胜，万超群，等.北京郊区某新兵训练营地发生一起博杰曼军团菌病暴发[J].中华流行病学杂志,2001,22(3):182-183.

[4] Ning ZQ, Wang BL, Liu XF, et a. Investigation of an legionnaires' disease outbreak[J].Chin J Public Health, 2004, 20(7): 859. (in Chinese)

宁召起, 王宝兰, 刘晓峰, 等.一起军团菌病暴发调查报告[J]. 中国公共卫生, 2004, 20(7)：859.

[5] Joseph CA, Ricketts KD. Legionnaires'disease in Europe 2007-2008[J]. Euro Surveill, 2010, 15(21):19493.

[6] Yabuuchi E, Agata K. An outbreak ofLegionellosisin a new facility of Hot Spring Bath in Hiuga city[J]. Kansenshogaku Zassh, 2004, 78(2): 90-98.

[7] Li SX, Chen XP. Investigation on contamination ofLegionellapneumophilain recycled water from central air conditioning systems and shower water in large hotels of an urban district in Beijing[J]. J Envir Hyg, 2014, 4(3): 226-230. (in Chinese)

李嵩雪, 陈西平. 北京某城区大型酒店集中空调循环水及淋浴水嗜肺军团菌污染调查[J]. 环境卫生学杂志,2014,4(3):226-230.

[8] Liu WY, Si GJ, Xu SS, et al. Characteristics ofLegionellapollution of central air conditioning ventilation systems in some public places of Hangzhou,2013-2014[J]. J Environ Occup Med, 2016, 33(2): 163-166. (in Chinese)

刘卫艳，斯国静，徐珊珊,等.2013—2014年杭州市公共场所集中空调军团菌污染特征[J].环境与职业医学,2016，33(2)：163-166.

[9] Shen L, Xie XH. Report ofLegionellapneumophilacontamination on shower head of hotel bathroom[J]. Occup Health, 2013, 29(12): 1485-1486. (in Chinese)

沈莉,谢晓红.酒店浴室花洒头上检出嗜肺军团菌的报告[J].职业与健康, 2013, 29(12): 1485-1486.

[10] Qin T, Yan G, Ren H, et al. High prevalence, genetic diversity and intracellular growth ability ofLegionellain hot spring environments[J]. PLoS One, 2013, 8(3)：e59018. DOI: 10.1371/journal.pone.0059018

[11] Ministry of Health of the People's Republic of China.WS 394-2012 Hygienic specification of central air conditioning ventilation system in public buildings[S].Beijing:Standards Press of China,2012.(in Chinese)

中华人民共和国卫生部.WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范[S].北京: 中国标准出版社, 2012.

[12] Mahbubani MH, Bej AK,Miller R, et al. Detection ofLegionellawith polymerase chain reaction and gene probe methods[J]. Mol Cell Probes, 1990, 4: 175-187 DOI: 10.1016/0890-8508(90)90051-Z

[13] Diederen BM,de Jong CM,Kluytmans JA, et al. Detection and quantification ofLegionellapneumophilaDNA in serum: case reports and review of the literature[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(5): 639-642. DOI: 10.1099/jmm.0.46453-0

[15] Zhou HJ, Ren HY, Zhu BQ, et al. Optimization of pulsed-field gel electrophoresis forLegionellapneumophilasubtyping[J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(5), 1334-1340. DOI: 10.1128/AEM.01455-09

[16] Dice LR. Measures of the amount of ecgical association between species[J]. Ecology, 1945, 26: 297-302.

[17] Sikora A, Wójtowicz-Bobin M, Kozio-Montewka M, et al. Prevalence ofLegionellapneumophilain water distribution systems in hospitals and public buildings of the Lublin region of eastern Poland[J]. Ann Agric Environ Med, 2015, 22(2): 195-201. DOI: 10.5604/12321966.1152064

[18] Matuszewska R, Krogulska B. Problem wystepowania paeczekLegionellaw instalacjach i urzadzeniach wytwarzajacych aerozol wodno-powietrzny w obiektach suzby zdrowia[J]. Nowa Med, 2009, 1: 56-60

[19] Bartram J, Yves CH, Lee JV, et al.Legionellaand prevention oflegionellosis[J]. World Health Ogranization, 2007，193：101-102.

[20] Matuszewska R, Krogulska B. Wystepowanie bakterii z rodzajuLegionellaw systemach wody chodniczej[J]. Roczn PZH, 2008; 59(4): 445-454.

[21] People's Republic of China National Tourism Administration. LB/T 016-2011 Classification & Accreditation for service-rated Hot Spring Enterprise[S]. Beijing: Standards Press of China, 2011.(in Chinese)

中华人民共和国国家旅游局. LB/T 016-2011温泉企业服务质量等级划分与评定[S].北京: 中国标准出版社, 2011.

[22] Mouchtouri V, Velonakis E, Tsakalof A, et al. Risk factors for contamination of hotel water distribution systems byLegionellaspecies[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(5): 1489-1492. DOI: 10.1128/AEM.02191-06

[23] Buse HY, Schoen Mary E, Ashbolt NJ, et al.Legionellain engineered systems and use of quantitative microbial risk assessment to predict exposure[J]. Water Res, 2012, 46(4): 921-933. DOI: 10.1016/j.watres.2011.12.022

[24] Zhang LY, Li Y, Zheng WL, et al. Sequence-based typing ofLegionellapneumophilaisolates from the public cooling tower water[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(3): 262-266, 273. (in Chinese)

章乐怡, 李毅 ,郑文力, 等.公共场所冷却塔水嗜肺军团菌的基因序列分型研究[J].中国人兽共患病学报,2013, 29(3):262-266，273.

Contamination status and molecular typing ofLegionellapneumophilain spring environments

ZHANG Le-yi1, Li Yi1, SHANGGUAN Zhi-hui1, WU Yue-jin1,XIE Ai-rong1, WANG Liang-huai1, CHEN Wen-bin2

(1.WenzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325000,China；2.TaishunCenterforDiseaseControlandPrevention,Taishun325500,China)

To research the contamination status and distributive regulation ofLegionellapneumophilain samples from spring water and analyze the main serotypes and genotypes of the pathogen, a stratified sampling method was adopted to collect water samples randomly from water tank, hot spring pool, shower room of hot spring recreations. Suspected strains were isolated from condensed water samples. Serum agglutination assay and real-time PCR technology were used to identifyL.pneumophila. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and sequence-based typing (SBT) were used to describe the genetic polymorphism of the isolates. Overall, 53.85% of water samples showedLegionella-positive, and their concentrations ranged from 20 CFU/100 mL to 16 000 CFU/100 mL. The main serotypes were LP1 type and LP3 type and all strains carrieddotgene. Among them, 40 isolates were analyzed by PFGE by which 10 distinct patterns were differentiated. They were also selected for SBT analysis and divided into 13 different sequence types in 3 main clonal groups belonging to one homomorphic type. Our results demonstrated high prevalence and genetic polymorphism ofLegionellain hot spring recreations of Wenzhou. Hot spring area posed a potential threat to tourists. Spring water of these places should be intervened to prevent occurrence ofLegionnaires' disease.

spring water;Legionellapneumophila; molecular typing; genetic diversity

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.010

1.温州市疾病预防控制中心，温州 325000； 2.泰顺县疾病预防控制中心，泰顺 325500

R378

A

1002-2694(2016)12-1096-06

2016-08-16；

2016-10-28

温州市科技计划项目(No.Y20150311)资助