后纵韧带骨化症发病机制的研究进展

贺中原 刘希哲 周治宇 刘少喻

后纵韧带骨化症(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是以脊柱韧带异位骨化为特点的常见疾患[1]。亚洲人群较欧美常见，其中日本发病率最高，为1.9%～4.3%;中国人群发病率约为3.08%。发病以C5最为多见，其次为C4和C6。大多数OPLL发生在40岁以后，平均发病年龄50岁，男性发病几乎是女性的两倍[2-5]。随着骨化的进展，特别是骨化块厚度的生长导致颈椎管逐渐狭窄，脊髓和神经组织受压损伤，可导致不同程度四肢感觉、运动、大小便障碍、植物神经功能紊乱等临床症状，甚至瘫痪[6-7]。目前对于后纵韧带骨化症机制的研究包括遗传因素、内分泌、生物力学因素、细胞内外细胞因子作用、生活习惯等。

一、与OPLL相关的易感基因

研究提示OPLL并不遵循简单的单基因孟德尔遗传模式。尽管遗传模式不清楚，但在OPLL患者中似乎有很强的家族联系，多个候选基因可能与遗传有关。虽然这些研究对后纵韧带骨化症的病因和发病机制有一定解释，但仍需更进一步探索。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)产生叠加效应增加对OPLL的易感性与OPLL发展密切相关。Kawaguchi等[8]证实BMP2基因在OPLL骨化韧带中诱导软骨和骨形成。Yan等[9]发现BMP2基因第2外显子109T>G多态性与Smad4蛋白表达水平和ALP活性呈正相关，Smad介导的信号通路在BMP2基因SNPs诱导OPLL的病理过程中起重要作用，所以认为BMP2是OPLL的易感基因；BMP4在中胚层诱导、牙齿发育、肢体形成和骨折修复中也有作用。研究为BMP4、BMP9基因多态性与OPLL的发生之间的联系提供了证据，其证实单倍型不仅与患者OPLL的发生有关，而且与OPLL严重程度的增加有关[10-11]；BMP7基因影响骨骼和周围基质矿化的通路[12]。BMP7功能缺陷可能同时导致成骨细胞和血管平滑肌细胞分化减少，但与OPLL是否有关还需进一步研究证实。

TGF-β存在于OPLL软骨细胞和邻近软骨区的骨化基质中，但不存在于MSCs和非骨化韧带中，提示它可能刺激异位骨化后期的骨形成。TGF-β基因，特别是TGF-β1，由于其在调节骨代谢中的重要性，它被认为是增加个体对OPLL易感性的主要候选基因；其第1外显子869T>C多态性在OPLL发病机制中的作用已被广泛研究，但研究结果并不一致。Han等[12]认为SNP 869T>C与OPLL的患病率没有显著关联。但分层分析显示，C等位基因为869T>C的患者在颈椎、胸椎或腰椎中显示OPLL的频率更高[13]。

Nakamura等[14]发现NPPS基因中从内含子20(IVS20-11delT)位点上游11个核苷酸位置的T缺失的个体更容易发生脊柱韧带的异常骨化，这表明存在这种缺失与OPLL存在显著关联。研究OPLL最常见的动物模型之一ttw(tiptoe walking)小鼠，表现出与人类OPLL非常相似的韧带骨化，它的表型也是由编码核苷酸焦磷酸酶的Npps基因的无义突变(568甘氨酸变为终止密码子)引起的，这种酶通过产生无机焦磷酸盐调节软组织钙化和骨矿化[15-16]。

COL6A1已被鉴定为日本人OPLL的易感基因。Kong等[17]对338名中国汉族受试者进行了COL6A1基因多态性的基因分型，认为COL6A1多态性与中国汉族人群对黄韧带骨化和OPLL的易感性有关。Wang等[18]也对30例中国汉族人群基因组测序，在白细胞介素17受体C(IL17RC)和胶原VIα1链(COL6A1)基因中发现了5个单核苷酸多态性(SNPs)可能与纵韧带骨化有关；COL11A2编码的细胞外基质蛋白可能为成骨细胞或软骨细胞提供支架，这些细胞随后进入膜性或软骨内成骨过程，提示COL11A2可能参与OPLL发病过程[19]。Wei等[20]对两个不相关的中国南方城市OPLL患者进行了全外显子组测序(WES)，认为COL17A1中的SNPs rs805698和rs4918079与OPLL显著相关。

IL15RA、IL17RC基因多态性与骨量、肌肉力量和代谢综合征等有遗传关系。类风湿关节炎患者血清和滑膜液中IL15水平明显高于骨关节炎，与疾病活动度相关。并且IL15通过IL15RA介导可促进破骨细胞的发生。Kim[21]发现IL15RA的SNP(rs2228059,exon 4,Asn182Thr)与韩国人群OPLL易感性有关。同时Guo等[22]也发现IL15RA基因rs2228059的SNP与中国汉族人群(尤其是男性)OPLL易感性相关。IL17RC基因可能通过IL-17信号通路促进成骨，可能参与OPLL的异位成骨过程。Wang等[23]发现IL17RC基因rs199772854A位点多态性是OPLL疾病的潜在致病突变。

成纤维生长因子(fibroblast growth factor,FGF)介导骨形成的特征是间充质细胞的复制和骨祖细胞向成熟成骨细胞的分化，并以成骨细胞凋亡结束。FGF通过成纤维细胞生长因子受体(FGFR)控制多个与成骨细胞分化和凋亡相关的基因。Jun和Kim[24]研究发现FGFR1的SNP与OPLL显著相关，FGF2中的SNP与OPLL 共病相关。

根据对OPLL双生子和家族谱系的研究,Matsunaga等[25]报道了位于常染色体6上的易感人白细胞抗原(HLA),就此推断OPLL遗传因子位于常染色体6上。OPLL患者与正常人群相比某些调控骨、软骨和韧带代谢的多样性基因出现的机率较高, 这些基因可能与OPLL的发生有关。除此之外还有许多与OPLL相关的易感基因，包括：VKORC1、BID、PTCH1、TLR5、ACE、AHSG、RXRB、IL-1β、VDR等。

二、与OPLL相关的细胞内外因子

细胞外间质及体液成分是维持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的微环境，细胞内外微环境的变化可以导致骨赘形成，而环境中的分子之间的相互作用是复杂的。Matsunaga和Sakou[26]认为骨形成和代谢异常与OPLL高度相关，在OPLL病程中，激素、细胞内外因子被认为参与了骨形成和代谢的调节。

骨形态发生蛋白(BMPs)是骨形成的重要调控因子。重组BMP-2已被证明可诱导大鼠异位骨化形成，并且在OPLL邻近的软骨细胞以及在软骨区附近的成纤维间充质细胞中；BMP2也参与了OPLL的形成。Tanaka等[27]从OPLL患者及非OPLL的脊髓韧带细胞进行体外培养，用BMP-2处理脊髓韧带细胞，检测其碱性磷酸酶活性。发现外源性BMP-2可促进脊柱韧带细胞的成骨分化。BMP-2在脊柱韧带中的表达可能为阐明韧带组织中异位成骨的发生发展提供线索。

缝隙连接蛋白是跨膜通道，在细胞胞质之间提供双向通信，而在骨细胞中的最丰富的连接蛋白家族成员是连接蛋白43(Cx43)。在骨骼中，大量系统性和局部产生的信号被转换成生物信号，并传输到特定位置的细胞，促进骨骼形成。因此，Cx43可能在OPLL发育过程中的信号传递中发挥重要作用[28]。Chen等[29]通过分比较OPLL与非OPLL患者体内、外Cx43蛋白表达水平，证明了Cx43介导的NFkB(p65)信号转导不仅在机械应力诱导的OPLL中发挥重要作用，同时也引起韧带成纤维细胞炎症反应的激活。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是半胱氨酸分泌蛋白，CTGF/Hcs24 mRNA在肥大软骨细胞中表达最高。重组CTGF/Hcs24(rCTGF/Hcs24)促进软骨细胞和成骨细胞在体内外和血管生成中的增殖和分化。在小鼠模型中，CTGF/Hcs24在骨折愈合过程中表达上调，提示CTGF/Hcs24在体内可能参与了软骨内成骨和膜内成骨作用[30]。Yamamoto[31]对OPLL患者的骨化韧带组织进行CTGF/Hcs24特异性抗体免疫组化染色，发现CTGF/Hcs24增强了OPLL患者韧带细胞ALP的表达，而非OPLL细胞ALP的表达无明显变化，说明可能是启动脊柱韧带细胞成骨的重要因素。

除ttw小鼠外Zucker脂肪大鼠(ZFR)是另一种后纵韧带自发骨化模型，其瘦素受体功能异常。Yamamoto和Kosaka[32]利用携带瘦素受体基因(fa)突变的Zucker脂肪大鼠(fa/fa)和经谷氨酸钠处理的肥胖大鼠(MSG)(因下丘脑腹内侧核破坏而肥胖)研究了胰岛素/IGF-1信号和瘦素信号在脊柱韧带细胞中的作用。其结果表明, 胰岛素样生长因子1(IGF-1)可以诱导成骨的OPLL细胞分化。

P2Y1基因是G蛋白倍增受体的超家族成员。据报道，成骨细胞在分化和增殖过程中通过P2Y1受体对细胞外核苷酸作出反应。并且OPLL患者的韧带细胞在机械应力作用下，表现出高水平的P2Y1表达，并释放出三磷酸腺苷(ATP)。Tanaka等[33]通过转染P2Y1,发现BMP-2 mRNA水平的升高与OPLL细胞中P2Y1 mRNA表达水平显著正相关，而非OPLL细胞中则呈负相关。表明P2Y1在OPLL和非OPLL细胞中的表达和对P2Y1刺激的某些反应存在差异。

蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)在成骨细胞分化中起重要作用。人因蛋白激酶R样内质网激酶(proteinkinaseR-likeERkinase,PERK)突变缺失可导致Wolcott-Rallison综合征(WRS)。这是一种常染色体隐性遗传疾病；其特征为I型糖尿病的早期发病、生长迟缓、多发性骨骼功能障碍，包括骨骺发育不良、骨折、晚期骨质疏松。Chen等[34]证实与非OPLL患者相比，OPLL患者的细胞PERK显著上调。特异性siRNA靶向PERK转染72 h后，OPLL患者细胞中成骨相关基因(OCN、ALP、COL I)的mRNA表达明显降低，提示PERK介导的内质网应激可能参与了OPLL的发生发展。

肌节同源结构域同源框基因转录因子(Msx)功能突变的丧失和获得可导致颅骨发育的严重缺陷。Msx2可能直接与DNA结合促进成骨细胞分化，并可能通过蛋白-蛋白相互作用与Runx2结合抑制矿化。研究表明，稳定下调PDL-L2细胞中Msx2的表达可诱导成骨细胞分化，从而导致基质矿化[35]。相反，细胞中稳定表达的Msx2阻止了成骨细胞的分化和基质矿化。因此，Msx2在OPLL细胞系中呈负调控,在防止韧带和肌腱矿化方面起着关键作用。

Runx2是成骨发生的主要调节因子，是间充质细胞向成骨细胞分化的关键；而Runx2的强烈表达可将成纤维细胞转分化为成骨细胞。在OPLL中，Runx2在异位骨形成之前就已被诱导，而Runx2单倍性不足可以改善OPLL相关的异位钙化。以ttw小鼠为研究对象，将其与杂合子Runx2小鼠杂交以降低Runx2的表达，并可利用3D-micro CT进行组织学和定量放射学分析[36]。这表明Runx2表达增加是OPLL小鼠模型中形成完整的OPLL表型的先决条件。

三、与OPLL相关的生物力学

OPLL患者颈椎单开门手术后，由于后柱不稳导致骨化韧带短期内增厚。临床证据支持这一假设，即机械应力是OPLL进展中起重要作用的局部因素之一。机械刺激激活信号通路，最终调节基因表达和蛋白质合成。近年来，越来越多的学者深入研究机械应力与后纵韧带骨化症发展关系，影响机制尚不清楚[37]。

Chen等[38]发现，机械应力可以上调韧带成纤维细胞中Cx43的表达；该信号转导的机械信号以促进成骨细胞分化；并且证明机械应力上调的Cx43可能部分通过激活细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和细胞分裂素活化蛋白激酶(P38)信号来促进韧带成纤维细胞的成骨分化。Shi等[39]比较OPLL和非OPLL患者韧带成纤维细胞通过力学加载后内质网应激标志物在体内的表达情况，研究了内质网应激对激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响。他们在OPLL患者体内外均观察到内质网应激的激活。机械应力可激活后纵韧带成纤维细胞内质网应激反应，进一步促进离体OPLL的形成。在这个过程中，内质网应激可能通过MAPK信号通路发挥作用。Chen等[40]采用瘦素刺激OPLL细胞，并通过柔性细胞张力系统施加机械应力，并评价成骨分化，证明瘦素和LepR在OPLL组织中有差异表达，瘦素/LepR和机械应力联合作用通过MAPK、JAK2-STAT3和PI3K/Akt信号通路促进PLL细胞成骨分化。综上所述，机械应力可激活后纵韧带成纤维细胞应激反应，通过信号通路发挥作用进一步加速OPLL的进展。

四、干细胞与OPLL

异位骨化(heterotopic ossification,HO)是软组织中骨形成的过程。这通常发生在最初的软骨形成，然后是软骨内成骨。近年来关于异位骨化的研究表明异位软骨和骨来源于内皮细胞及间充质干细胞。血管内皮细胞通过内皮-间质转化产生的间质干细胞中间体向骨骼细胞分化[41]。Liu[42]通过比较ttw小鼠和未发生骨质增生的野生型小鼠间充质干细胞的成骨潜能和行为特征，证明ttw小鼠肌肉脂肪组织来源的间充质干细胞具有较高的成骨潜能。Asari等[43]证明了间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存在于人类脊柱韧带中，将其分离并原位定位。Chin等[44]也发现MSCs在人脊髓韧带血管周围和胶原基质中的存在。此外，还观察到MSC和周细胞标记物在血管周围区域的共同表达。韧带异位骨化前软骨细胞MSC标记表达阳性，异位骨化韧带中MSCs的检出率明显高于胶原基质中非异位骨化韧带的检出率。所以MSCs在OPLL骨化过程中可能起关键作用。

五、其他非遗传因素

OPLL的非遗传因素包括年龄、糖尿病、肥胖、饮食、运动和机械刺激等，与血浆戊糖苷水平、股骨颈骨密度(BMD)和弥漫性特发性骨质增生(DISH)也与OPLL相关。OPLL也可能是其他疾病的继发性并发症，如低磷性佝偻病/骨软化症、甲状旁腺功能减退症和肢端肥大症、巨人症，这些疾病常导致早发和严重OPLL。而大多数OPLL病例是原发性的(特发性的)。

后纵韧带骨化症是一种涉及脊柱韧带异位骨形成的多因素疾病。近几十年来对OPLL发病机制的研究揭示了许多遗传和非遗传因素参与了OPLL的发生和发展。虽然在OPLL标本中已经发现了许多具有特异SNP的OPLL易感基因，但大多数研究都是基于小样本量和少量经检测的序列变异。此外，由于这些SNPs缺乏进一步的功能特性，与OPLL相关的SNP是否是OPLL发生和发展的功能性后果尚待确定；在生物力学上许多学者也发现力学刺激能激活多种信号通路从而促进体外OPLL成纤维细胞具有成骨分化的功能，但大部分都是在体外单一力学加载作用下完成。通过在体外进行的细胞学试验，不能完全模拟颈椎屈伸及旋转力量的影响。近年来也发现脊柱韧带及周围间充质干细胞这一系列干细胞及内皮细胞的新证据。这为OPLL的分子机制提供了新的见解。然而，异常信号如何从周细胞中招募MSCs并将其转化为异位骨化仍是有待解决的关键问题，应该是未来研究的方向和重点之一。总之,OPLL是一种多基因与遗传有关，在体内外多种理化及生物因素作用下导致的疾病，其发病机制还需进一步研究。