激活成骨细胞低氧诱导因子1α通路促进骨形成及参与调节骨改建过程

邓廉夫 邱明龙

骨发生发育及其骨形成依懒于软骨内化骨、膜内化骨，以及贯穿其中的骨形状适应性变化的骨塑建过程。骨生长发育趋于终结后的骨组织，新骨的形成量及其形状不再发生明显的塑建性变化，而是以骨改建的方式，使骨形成和骨吸收处于动态平衡的状态。这既可维持新旧骨组织的更替和正常骨构筑的完整性，又有助于保证体内矿物质的水平及其生理性功能。

一、骨形成与骨改建过程调节机制的研究重点在向低氧微环境聚焦

在骨塑建/骨改建过程中，先由破骨细胞“移除”陈旧骨组织，成骨细胞则随之在“骨吸收陷窝”处形成新骨。周期性发生的骨吸收和骨形成不是随机沿骨表面进行的，而是分别由精确协调下的成骨细胞与破骨细胞发生在特殊的解剖部位和遵循着严格顺序的生物学事件。

自出现成骨细胞调节破骨细胞生成和发育的假说后，逐渐明晰的基本共识观点认为，成骨细胞除肩负“骨形成”的使命外，还可通过目前已知的巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony stimulating Factor，M-CSF)和骨保护素/核转录因子-κB受体活化因子配体(osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor κB ligand,OPG/RANKL)二个关键调节途径，决定着破骨细胞的生成与活性。成骨细胞分泌的M-CSF，首先赋予邻近骨表面的单核细胞分化为破骨细胞的潜能，成为破骨细胞前体细胞；成骨细胞产生的RANKL，则可趋化破骨细胞前体细胞募集至骨表面的骨吸收部位，并与破骨细胞前体细胞膜表面的RANK结合，其信号经细胞内级联反应，进而调节破骨细胞前体细胞相互识别、逐渐融合并演化为成熟的破骨细胞而发挥骨吸收活性。与此同时，成骨细胞分泌RANKL的诱饵受体-OPG，二者结合后竞争性地阻碍RANKL与RANK相互作用，继而抑制破骨细胞的分化和功能[1]。长期以来，有关成骨细胞与破骨细胞功能的“耦联”及其精细调节机制的研究，尽管在系统性、局部性和“耦联”因子等方面获得了理论认识和以其为基础的防治代谢性骨病的长足进展，但随研究深入，近十余年来逐渐向骨组织细胞生活的微环境方向聚焦。骨组织细胞处于低氧微环境，是其显著特征之一[2]。

自发现低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIFs)以来，这一反映生命活动氧依赖机制的重要组成部分，其意义和前景一直予以高度关注。HIFs是迄今发现的组织细胞在低氧状态下诱生的最直接的唯一调控因子，包括3种亚型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)。低氧对骨生物学特性的调节主要通过HIF-1及其氧感应元件HIF-1α介导[3]。HIF-1α肽链序列中的脯氨酸残基，在依赖氧、Fe2+、抗坏血酸等催化的脯氨酸-4-羟化酶(proline-4-hydroxylase,PHDs)作用下发生羟基化，羟基化的HIF-1α被称之为肿瘤抑制蛋白(p tumor suppressor protein Von Hippel-Lindau,pVHL)识别、泛素化，最终被蛋白酶体降解。当细胞处于低氧和/或Fe2+匮乏而导致PHDs的活性降低或失活时;或当VHL表达降低乃至缺失时，其结果将引起HIF-1α聚积并转运至细胞核，与核内HIF-1β形成聚合体HIF-1，进而激活涉及细胞不同功能的、众多的HIF-1靶基因转录，从而引发组织细胞包括血管新生与重塑、葡萄糖和能量代谢、细胞增殖、凋亡、分化等一系列的耐氧适应性分子反应[4]。

二、激活成骨细胞HIF-1α通路通过诱导骨组织血管新生而促进骨形成

骨组织细胞属氧感应细胞，在低氧或模拟低氧环境内可表达HIF-1，进而调节细胞表型发生效应性变化。采用条件性敲除成骨细胞Vhl基因小鼠的研究发现，激活成骨细胞HIF-1α通路，HIF-1可直接触发下游靶基因-血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，诱导骨组织血管新生而“耦联”骨形成过程，促进骨形成[5]。随后的研究进一步表明，激活成骨细胞HIF-1α通路，因新生血管增加而促进骨折愈合进程中的骨痂形成[6-7]；HIF-1α通路对成骨细胞的这种调节作用还可有效对抗因雌激素水平低下而引起的进行性骨丢失[8]。骨组织中，与骨形成过程相“耦联”的新生血管，主要是H型毛细血管。H型毛细血管内皮细胞，以丰度表达CD31、内皮粘蛋白(endomucin)为特征，所营造的独特微环境可介导骨生成细胞选择性的定位其附近，促进骨生成细胞向成骨细胞分化[9]。

改善骨微环境、提高细胞HIF-1α的表达水平，将有益于促进骨组织血管新生、建立新的血供，加速骨形成。然而，值得关注的问题是，条件性敲除成骨细胞Vhl基因而持续、高表达HIF-1α的小鼠，长骨骨量进行性增加，至出生后6周龄小鼠的骨髓腔近乎完全被骨组织充填，表现为骨塑建/骨改建过程偏向过度骨形成的“失衡”现象，类似于“骨硬化症(osteopetrosis)”的组织形态学特征[5]。

三、激活成骨细胞HIF-1α通路促进骨形成的非血管因素

血液中的单核细胞可随血流贴近(附)于骨组织表面，伺机生成破骨细胞并发挥骨吸收活性，以“平衡”骨塑建/骨改建过程[1]。因此，在成骨细胞HIF-1α通路激活后的骨形成“过度”增加，除通过诱导血管新生而促进骨形成的机制外，还存在其它调控因素或原因。

1.激活成骨细胞HIF-1α通路可通过VEGF/HO-1作用途径介导基质干细胞成骨性分化:基质干细胞(MSCs)作为成骨细胞的补充源，其成骨性分化受多种因素调节。近年来有关MSCs低氧/HIF-1α通路直接参与调控其自身成骨性分化的研究结论，尚存有争议甚至相悖[10-11]。贴附于骨表面的成骨细胞所产生的调节因子，释放至骨髓腔可引起骨髓腔微环境的变化而调节骨髓细胞的分化方向。应用条件性敲除Vhl基因的成骨细胞的上清液制备条件培养液，可刺激骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSCs)表达血红素氧化酶(heme oxygenase,HO)-1；随HO-1表达量增加及其活性升高，BMSCs增殖活跃、成骨性标志物表达水平升高；这一现象可因添加VEGF抗体被部分阻断;而加入HO-1α激动剂可逆转VEGF抗体对培养的BMSCs增殖和成骨性分化的抑制作用。研究表明，Vhl基因条件性敲除后激活HIF-1 通路的成骨细胞，分泌VEGF并释放至骨髓腔，诱导BMSCs表达HO-1，进而调节BMSCs优先转向成骨性分化，抑制其成脂性分化[12]。

2.激活成骨细胞HIF-1α通路可阻抑破骨细胞的生成和分化：低氧/HIF-1α通路直接调节破骨细胞分化的相关研究较少。模拟低氧环境以稳定骨髓源性单核细胞HIF-1α的蛋白水平，可延迟单核细胞相互识别、逐渐融合的破骨细胞生成过程[13]。在条件性敲除成骨细胞Vhl基因小鼠的骨髓腔，白细胞介素(interleukin,IL)-33的浓度明显升高和破骨细胞数量显著减少。体外进一步就其发生机制的研究表明，因Vhl基因敲除而累积于成骨细胞胞浆的HIF-1α，入核后可直接结合于IL-33基因的启动子并激活IL-33表达；由成骨细胞分泌的IL-33，可抑制源于骨髓的单核细胞向破骨细胞分化，其作用在破骨细胞分化的早期阶段尤为明显；IL-33抑制破骨细胞生成与分化的作用，是通过诱导破骨细胞前体细胞表达miR-34a-5p，进而激活Notch-1基因的表达而实现的。由此，激活成骨细胞HIF-1α通路，可通过IL-33/miR-34a-5p/Notch1途径抑制破骨细胞的生成与分化这一新的作用机制，参与调控骨塑建/骨改建过程[14]。

3.激活成骨细胞HIF-1α通路可延迟其向骨细胞演化的进程进而参与调节骨塑建/骨改建过程：成熟的成骨细胞将发生凋亡、演变为骨细胞和转化为衬里细胞3种归宿。当终末分化的成骨细胞被自身形成的骨基质包埋后，即“演变”为骨细胞，历经以表达E11/gp38为标志物的早期阶段、以表达牙本质基质蛋白(Dmp1)为标志物的中期阶段，分化发育为以表达骨硬化蛋白(sclerostin)为标志物的晚期骨细胞。在骨细胞表型变化进程中，细胞体积瘦身、渐狭长、变小，细胞骨架重排、膜突起数量进行性增加(平均可多达80个左右的树状突起)。尽管仅10%～20%的成熟成骨细胞转化为骨细胞，但与成骨细胞(数周)和破骨细胞(数天)的相对短暂存活和局限于分布骨表面所不同的是，骨细胞生存期可达25年或更久，广泛分布于骨组织中。因此，成人骨组织中90%～95%为骨细胞。骨细胞胞体被埋于骨陷窝内，通过与骨陷窝连通的骨小管中的细胞突起，建立起骨细胞间、骨细胞与骨表面贴附的细胞间，以及骨细胞与骨微血管间广泛的立体网络联系，以保障骨细胞的活性及其功能发挥[15]。骨细胞作为膜性和可溶性RANKL、骨硬化蛋白的最主要来源而调节骨塑建/骨改建过程；这依赖于骨细胞形态结构及其功能完整性、生物学信息的传递与应答的准确性[16]。

伴随Vhl基因缺失而持续、高表达HIF-1α，显示成骨细胞向骨细胞演变、骨细胞的分化进程延缓或受阻，骨组织欠成熟的现象。主要表现为成骨细胞多层排列(甚至堆积)于骨组织表面；在新生的大量骨基质中，多角形、椭圆形骨细胞密度增加，胞体较饱满、轴向性排列不明显，甚至出现膜内转录因子Osterix(Osx)阳性的幼稚成骨细胞；中、晚期骨细胞数量明显降低，细胞突起短、少，缺乏典型的树突状突起及突起间网络联系的特征；骨基质中排列紊乱的胶原基质堆积、钙化不均或不完全，骨微生物力学性能下降[17]。鉴于骨细胞可调控其周围类骨质重塑与矿化，通过RANKL信号轴刺激破骨细胞吸收活性、骨硬化蛋白信号轴抑制成骨细胞生成及其成骨性能，进而调控骨改建过程的独特“枢纽”地位，骨细胞生成、发育、成熟的有序进程延迟，可能是造成骨塑建/骨改建过程偏向骨形成"过度"增加，但并不成熟的组织学表现的主要原因之一。

骨组织细胞HIF-α通路的准确应答机制关乎骨稳态及骨骼健康[18]。激活低氧/HIF-α通路可促进骨形成的有益作用，正在引导药用低氧模拟化合物的研发及骨病损的防治，并呈热点研究内容的发展趋势[19-20]。针对随增龄骨组织进行性血供不足，基质干细胞数量减少及其成骨性分化潜能低下、破骨细胞骨吸收活性增强等特点，应用低氧模拟化合物以激活细胞HIF-1α通路，通过诱导血管新生、促进基质干细胞成骨性分化、抑制破骨细胞生成及其骨吸收活性等功效，可呈现促进骨修复和防治骨退变的优势效果；但应以低氧模拟化合物适量及其适时、适度刺激细胞表达HIF-1α为前提，以避免可能发生的新生骨组织“过度”形成、骨质量欠佳的后果。

综上所述, 低氧/低氧诱导因子(HIF)-1 通路对骨组织细胞生物学特性的调节作用，日趋受到关注。激活成骨细胞HIF-1 通路可通过诱导骨组织血管新生、介导基质干细胞成骨性分化、阻抑破骨细胞生成及其骨吸收活性，以及延缓成骨细胞向骨细胞演变及骨细胞分化进程等，促进骨形成和参与调节骨塑建/骨改建过程。但在药用低氧模拟化合物的研发及其防治骨病损的应用中，应以适量、适时、适度调节细胞表达HIF-1α为前提，以规避可能发生的新生骨组织“过度”形成、骨质量欠佳的后果。