二甲双胍的自噬机制和自噬相关应用前景进展

韦少钗，李冠武

（汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，肿瘤分子生物学开放实验室，广东 汕头 515041）

引 言

细胞自噬是利用溶酶体内水解酶降解细胞质中受损成分和细胞器，使细胞应对各种刺激环境，从而维持细胞内稳态的一种高度保守的自我调节机制.按照底物进入溶酶体的方式，细胞自噬分为3 种途径，分别为细胞自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[1].根据降解底物有无专一选择性，自噬可分为非选择性自噬和选择性自噬[2].非选择性自噬对底物没有专一性，自噬过程一般先激活mTOR 通路的上游因子，通过Beclin1 复合体形成隔离膜，接着ATG12 和LC3/p62 系统对隔离膜的延伸从而形成自噬体，最终与溶酶体结合成自噬溶酶体对物质进行降解.另外一类细胞自噬可以专一性地降解特定的大分子或细胞器如线粒体、内质网等，这种自噬称为选择性自噬[3].

长期以来人们主要关注二甲双胍通过激活AMPK 能量信号通路，抑制mTOR 通路[4]，对自噬起始信号起调控作用.但是越来越多研究表明二甲双胍也能够对自噬流过程进行调控，同时参与线粒体和内质网等细胞器的调节[5].人们发现二甲双胍不仅对糖尿病的疗效显著，而且它能降低二型糖尿病患者许多恶性肿瘤（如结直肠癌、前列腺癌等）的发病风险[6-8]，甚至能延长二型糖尿病患者的生存时间[9]，因此二甲双胍通过调节自噬抗肿瘤以及抗衰老的作用引发人们强烈关注.但二甲双胍诱导自噬的分子机制尚不清楚，本文对以二甲双胍诱导细胞自噬机制及相关应用综述如下.

1 二甲双胍对自噬靶点的影响

1.1 mTOR 通路

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin）分为mTORC1 和mTORC2两种复合体，由于它们结构域不同，在细胞中起不同的作用[10]. mTORC1 主要结构是Raptor、PRAS40，参与自噬、溶酶体合成、脂质合成等途径. mTORC2 是由Rictor、SIN1、Proctor 组成，参与细胞增殖、代谢和细胞骨架组成相关途径[11].mTORC1 复合体作为自噬过程的中心枢纽，二甲双胍主要通过与其相关的PI3K/Akt/mTOR 途径跟LKB1/AMPK/mTOR 途径参与调节自噬过程. 生长因子能激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路，研究表明二甲双胍在体内可以降低胰岛素样生长因子，减少IGF-1 的合成与分泌[12-13]，使胰岛素受体底物不能活化细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），抑制AKT 磷酸化，进而抑制mTORC1 磷酸化，诱导细胞自噬或凋亡，最终抑制癌细胞生长[14-15].其次由于二甲双胍能抑制线粒体的活性，造成细胞能量缺乏，激发LKB1 激酶使AMPK 的Thr172发生磷酸化.活化的AMPK 激酶不但使mTORC1 上的raptor 的Ser792 位点磷酸化，同时磷酸化ULK1Ser317 跟Ser777 位点[16-17]，ULK1 与自噬相关基因（如Atg13、Atg17等）共同参与自噬隔离膜的形成[18]，共同调节自噬过程.

1.2 Beclin1 蛋白

Beclin1 可与Vps34、Ambral、Vps15、Atg14 形成PI3K-Beclin1 复合体参与形成自噬前膜，但是如果Beclin1 与Bcl-2 的BH3 结构域结合，就无法与Vps34 等形成PI3K-Beclin1 复合体，从而抑制自噬膜生成[19]. 研究者发现BNIP3 与Bcl-2 竞争结合Beclin1，导致Beclin1 与Bcl-2 分开，促进形成PI3K-Beclin1 复合体，诱发自噬体的形成[20].但是在高糖诱导细胞受损的情况下，二甲双胍会通过激发Hedgehog 信号途径，降低BNIP3 的表达，增加Beclin1 与Bcl-2 的相互作用，阻滞自噬进程[21].然而在H9C2 细胞中经二甲双胍处理后会激活细胞中Jun N 末端激酶1（JUNK1），JUNK1 的激活使Bcl-2Ser70位置发生磷酸化同时改变自身BH3 的结构域，使得Beclin1 与BCL2 解离，有利于自噬前体PI3K-Beclin1 复合物的形成[22-23].

1.3 二甲双胍与LC3 酯化和P62 连接系统

pro-LC3 蛋白的羧基末端被Atg4 切割，形成LC3Ⅰ状态，接着LC3Ⅰ在atg4 和atg7协作下使LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺（PE）形成LC3Ⅱ.LC3Ⅱ与atg5-atg12-atg16 蛋白复合体以及连接蛋白p62 一起使自噬体膜延伸形成自噬泡，参与受损物质的降解.CCAAT/增强子结合蛋白δ（CEBPD）是一种基本的亮氨酸拉链转录因子，能够作用于自噬相关蛋白LC3 的-978/618 和Atg3-1179/-537 位点，促进LC3 和Atg3 基因表达[24]. 二甲双胍作用于肝癌细胞（Huh7 细胞）中，通过降低Src 激酶在酪氨酸416 位点的磷酸化，降低蛋白酶体降解程度，从而增加细胞中CEBPD 蛋白，使LC3 和Atg3 表达上升[25]. 研究发现TRIB3 转录水平受到SMAD3 基因调节，能通过干扰p62 与LC3 的结合调节自噬信号通路.二甲双胍治疗黑色素瘤细胞时会抑制SMAD3 蛋白磷酸化，同时干扰赖氨酸乙酰基转移酶5（KAT5）对SMAD3K333 乙酰化，导致TRIB3 转录降低，减少其对p62 与LC3结合的影响，受损物质参与自噬[26].

1.4 二甲双胍促进自噬溶酶体的水解功能

溶酶体中含有50 多余种酸性水解酶，主要功能是接受和降解胞内受损的蛋白或细胞器.溶酶体膜上存在蛋白受体，溶酶体膜内的蛋白1 和2、v 型ATP 酶等具有维持结构完整与物质运输的功能[27].研究表明在二甲双胍作用下，可以通过转移折叠蛋白AXIN 和ULK1 共同聚集在溶酶体膜v-ATPase 受体上，从而形成v-ATPase-Ragulator-AXIN/ULK1复合体，促进溶酶体与自噬小体融合成自噬溶酶体[28-29].TAK1 是丝裂原活化蛋白激酶（MAP3K）的成员之一，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，可以调节蛋白水解酶、黏附分子等的表达[30].二甲双胍造成溶酶体损伤时，会使溶酶体囊泡中存在的Gal9（半凝集素9）代替膜上USP9X 和TAK1 复合体，接着使TAK1 在K63 泛素化，增强AMPK/ULK1 诱导自噬[31].近年来，人们发现TFEB 是调控溶酶体生成和细胞自噬的开关，正向调控溶酶体酸性水解酶跟膜蛋白的表达[32]. 研究表明二甲双胍作用于小鼠体内激活自噬标志Beclin1、LC3Ⅱ的表达，降低p62；同时增强TFEB 在胞质中和核中含量，从而提高组织蛋白酶的活性，提高溶酶体中酶的水解能力[33].

2 二甲双胍对细胞器的影响

2.1 线粒体自噬

由于受损线粒体上存在许多线粒体自噬效应分子，机体能产生专一的自噬机制清除受损的线粒体以维持细胞稳定状态，称为线粒体自噬.如今人们了解线粒体自噬效应分子主要由PINK1/Parkin 蛋白、Nix/BNIP3L 蛋白、MFN 蛋白和FUNDC1 蛋白组成[34].通过体内体外研究，二甲双胍抑制线粒体呼吸链上ComplexⅠ的活性，细胞内环境中NADH 形成NAD+受阻，天冬氨酸的水平下降，造成线粒体功能损伤，从而通过自噬途径清除受损线粒体[35].二甲双胍处理人外周血单核细胞，在电镜下表现为细胞中出现大量的线粒体自噬溶酶体，主要其能明显降低线粒体活性氧，使线粒体中的DNA 受损，促进线粒体膜上的PINK1、Parkin、Nix、MFN2 等蛋白表达，细胞能清除受损的线粒体，而且改善细胞功能[36].糖尿病的发病机理通常伴随着线粒体自噬受损和NLRP3 炎症小体的激活导致细胞死亡[37].研究表明在糖尿病心肌细胞中二甲双胍可以增强线粒体自噬，从而快速改变线粒体的形状和功能，通过抑制NLRP3 信号通路降低caspase1、IL-1 的表达，减少细胞坏死[38].

2.2 内质网应激

内质网自噬指在多种应激刺激下，内质网腔内出现错误折叠与未折叠的蛋白聚集或缺少胆固醇时，细胞引起内质网应激清除物质以维持蛋白质稳定所激发的选择性自噬.内质网应激与自噬的相互作用可以通过未折叠蛋白反应（UPR）的三种主要蛋白，即蛋白激酶R 样内质网激酶（PERK），跨膜激酶1α（IRE1α）以及激活转录因子6α（ATF6α）调控细胞稳态[39].研究表明，二甲双胍引起肿瘤细胞内能量缺乏，激活内质网膜上的感应器PERK，真核起始因子2α（Eif2α）被PERK 磷酸化，减少蛋白质合成，同时使LC3Ⅱ跟Atg5-Atg12 复合体上升，通过促进自噬增加受损蛋白降解[40].另有研究表明二甲双胍诱导的内质网应激在磷酸化Eif 2α 时也会激活ATF4，ATF4 转录调控ATG12，介导CHOP 活化ATG5，促进自噬隔离膜的延伸[41-42]. 内质网自噬存在六种自噬蛋白受体如（FAM134B、RTN3L、SEC62、CCPG1、ATL3、TEX264），但是关于二甲双胍所诱导的内质网自噬至今鲜有报道[43].

3 二甲双胍自噬机制对细胞的影响

3.1 抑制肿瘤增殖生长

大量实验研究表明，二甲双胍在诱导自噬后能通过阻滞细胞周期跟促进细胞凋亡来抑制细胞增殖.二甲双胍能使不同肿瘤细胞停滞在G0/G1 期、G2/M 期，抑制其增殖.在多发性骨髓瘤细胞（8226 和U266）和黑色素瘤中，二甲双胍诱导AMPK/mTOR 自噬途径，间接促进p53 的表达，从而使细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子（p21 和p27）表达上升，于是减少细胞周期蛋白CyclinD 含量，导致视网膜细胞瘤基因（RB 基因）无法被CyclinD 磷酸化，同时转录因子（E2F）不从RB 上能释放参与促进S 期蛋白的合成[44]，造成细胞阻滞在G0/G1 期[45-46].在肝癌细胞中二甲双胍提高转录因子CEBPD 的表达，可能会诱导肿瘤抑制基因miR-193b-3p 的表达，从而抑制原癌基因Cyclin D1 跟ETS1 表达[47]，造成细胞滞留在G1 期[25]. 二甲双胍能抑制Akt 的磷酸化，抑制mTOR 的活性，促发caspase 凋亡，增加caspase3 的切割，导致细胞凋亡[48].在肺癌细胞中，二甲双胍介导自噬促进LC3Ⅱ的上升同时使p62 下降，造成细胞发生肿瘤坏死因子（TRAIL）介导的凋亡[49].

3.2 抑制肿瘤侵袭迁移

恶性肿瘤容易发生侵袭转移，造成多种器官功能性损伤.上皮间质转化（EMT）将丢失紧密连接和黏附连接的有极性的上皮样细胞，转化成有迁移能力的间质形态和特征细胞的过程，大量研究表明二甲双胍能通过抑制EMT 抑制肿瘤细胞转移[15，50-52].二甲双胍治疗可以直接干扰PP2A 催化亚单位A4 和MID1 的关联，从而释放PP2A 的催化活性，进而抑制肺癌细胞侵袭[53]. YAP 是一种有效的致癌基因，它的异常调控会引起肿瘤发生，二甲双胍通过上调miR-381 表达，下降YAP 蛋白的表达，抑制非小细胞肺癌细胞迁移[54].此外，人们还发现诱导自噬后下降肿瘤转移相关因子（MTA1），这是另一个二甲双胍抑制肿瘤侵袭迁移的途径[55].

3.3 延缓细胞衰老

细胞衰老会不断积累损伤的蛋白跟细胞器，自噬可以分解细胞内受损物质，二甲双胍能通过氧化应激和AMPK 信号通路参与调节自噬，延缓衰老，缓解老年相关疾病[56].二甲双胍作为自噬激活剂治疗衰老的人牙周膜干细胞，它能减少衰老产生的氧化应激，降低衰老基因（p21、p16）的表达，同时激活自噬因子Beclin1、LC3Ⅱ，采用自噬抑制剂（3-MA）加快细胞衰老进程[57].衰老紊乱细胞内的能量状态，二甲双胍能通过调节能量感受器AMPK 的活性，改善细胞的衰老情况.小鼠在年老时容易造成神经损伤，二甲双胍能够通过激发AMPK/ULK1 依赖的自噬途径，提高海马突触密度，微管结合蛋白2（MAP2）和突触后密度蛋白95（PSD95）的含量，减少由七氟醚在老年小鼠中造成的神经损伤[58]. 二甲双胍在心肌细胞中能够激活细胞质中AMPKα/mTOR/TFEB 和细胞核中AMPK/βSkp2/CARM1/TFEB 的通路促进自噬[59].老年小鼠容易出现I/R 损伤性心肌细胞坏死，研究显示二甲双胍通过促进自噬可以降低坏死激活因子（p-RIP3 跟p-MLKL），同时干扰p62/RIP1/RIP3 复合体形成，使p62 能与LC3Ⅱ等自噬蛋白结合，恢复老年化受损的心肌细胞[60].

4 结语

二甲双胍作为T2DM 的首选药，不仅具有良好的降糖作用，而且能诱导多条信号通路参与对抗多个系统的肿瘤，其中二甲双胍诱导自噬通路起重要作用. 二甲双胍在诱导自噬时能对不同细胞的不同时期产生不一样的靶点控制，这可以利用二甲双胍设计靶向药物参与自噬的调节. 二甲双胍在多种刺激下能诱发选择性自噬（线粒体自噬、内质网自噬）的产生，达到抑制细胞增殖、侵袭迁移，同时还具有延缓细胞衰老等作用，因此仍需不断研究二甲双胍诱导自噬机制，进一步为治疗肿瘤提供更有效的思路和途径.