循环游离DNA的生物特性及其在乳腺癌中的应用

樊丽壮，王 博，徐爱兰，刘艳佳

（佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154003）

乳腺癌（breast cancer）是女性发病率最高的癌症，也是癌症死亡的主要原因[1]。目前，基因组测序已实现自动化，基因芯片技术变得更加成熟，分子生物学技术应用于乳腺癌已成为一种趋势。循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cf-DNA）是指血液或体液中游离于细胞之外的DNA。其检测具有操作简单、实时性、易于取样（且可重复取样）、灵敏度高、创伤性小等优点，在乳腺癌临床中具有明显优势，可作为一种容易被人们接受的检测手段进行大范围推广。本主要报道关于cf-DNA的研究及其乳腺癌中的应用进展，期望其能够在临床中大范围应用，提高乳腺癌的诊断率。

1 循环游离DNA的生物学研究

1.1 cf-DNA的生物学行为 cf-DNA 以三种不同形式存在体液中：游离细胞DNA 片段、囊泡结合DNA和DNA 大分子复合物，可分为两种主要类型：无细胞核（cf-nDNA）和线粒体DNA（cf-mtDNA）[2]。研究发现[3]，剧烈的体育锻炼可提高循环细胞线粒体DNA（cf-mtDNA）的水平。慢性肾功能衰竭与低cf-DNA 摄取和低血浆cf-DNA 水平相关，表明肾脏参与了cf-DNA的清除[4]。由于癌症患者cf-DNA 水平较高，确定其来源能够帮助鉴定和定位疾病。cf-DNA的片段化谱可能揭示癌症患者的组织起源[5]。然而，cf-DNA的水平在疾病的不同阶段含量不同。在早期阶段，它可能低至每5 ml 血浆中仅有一个基因组当量[6，7]。大部分cf-DNA 片段在80～200 bp[8]。cf-DNA 浓度及其链完整性可作为鉴定结核病与非小细胞肺癌的指标。此外，cf-DNA的完整性对区分非小细胞肺癌和结核病高于传统的肿瘤标记[9]。另外，cf-DNA 分析作为一种新兴技术在器官移植检测、无创产前检查（NIPT）和肿瘤液体活检等方面应用广泛[10-12]。

1.2 cf-DNA 中的特殊类型ct-DNA 肿瘤患者血浆内循环肿瘤细胞或原位肿瘤细胞释放进入循环的cf-DNA 称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ct-DNA）。ct-DNA 检测是当前研究的热点。ct-DNA 属于cf-DNA的一种类型，反映了不同肿瘤部位转移的大小和活性的动态变化[13]。其片段长度多小于160 bp[14，15]。ct-DNA 在循环中的半衰期短，一般为16 min～2.5 h，适用于肿瘤负荷的实时监测[16]。快速生长的肿瘤在自身坏死和肿瘤体积收缩时产生ct-DNA 峰值，表明持续的ct-DNA 释放可能需要活的肿瘤细胞[17]。ct-DNA 在乳腺癌中的应用首先建立在转移性疾病中，因为肿瘤负荷与其总量有关[18]。通过序列分析可以监测肿瘤内的异质性和克隆进化，从而改善疾病控制和指导治疗决策[19]。在乳腺癌早期，肿瘤负荷有限，ct-DNA 在患者血液中的浓度可能很低，因此早期发现乳腺癌仍然具有挑战性[20]。有研究检测到Ⅰ期或Ⅱ期乳腺癌患者血浆中的癌症突变，分析显示ct-DNA 浓度与患者肿瘤的变化高度一致，表明ct-DNA 分析有助于乳腺癌的筛查和管理[21]。

1.3 cf-DNA 与肿瘤体积的相关性 随着对cf-DNA的深入研究，cf-DNA 与肿瘤体积之间有相关性逐渐显露。肿瘤体积大、肝转移的患者的ct-DNA 检测率较高[22]；总代谢肿瘤体积和cf-DNA 高的患者无进展存活期较短[23]。ct-DNA 可作为癌症治疗期间的监测工具[24]。同时，cf-DNA 显示出在癌症治疗后成为反应评估的新生物标志物的潜力，可作为肿瘤体积的评估工具。

2 cf-DNA的检测

2.1 血液样本采集 血浆样品分析前处理的变化会影响cf-DNA 分析的结果[25]。昼夜循环和膳食消耗不会显著影响总cf-DNA，供体间血浆cf-DNA 浓度差异归因于人身体差异[26]。Madsen AT 等[27]的研究证明，当间隔3 h 进行5 次抽检时，血浆cf-DNA 浓度在最后抽检时下降。变异等位基因频率仅在96 h的EDTA 管中受cf-DNA 浓度波动的影响。BCT 和Cell Save 管均在96 h 时保持了最佳cf-DNA/ct-DNA 质量，且使用的防腐剂不影响dPCR的下游cf-DNA/ct-DNA 分析[28]。高容量等离子体收集装置收集的等离子体中存在高质量的cf-DNA。能够从单个个体收集大量的cf-DNA，将有助于临床操作、最小疾病监测和癌症的早期发现[29]。

2.2 血浆cf-DNA的提取 CANCER-ID 联盟使用人工插入血浆对实验流程进行了多中心评估，结果差异显著，因此谨慎选择cf-DNA 提取方法具有重要意义。Qiagen CNA 和MaxweⅡRSC 试剂盒相比，扩增的短尺寸片段和肿瘤特异性突变具有相似的完整性和水平。然而，Qiagen CNA 试剂盒始终显示出最高的cf-DNA 和短片段，而MaxweⅡRSC 和QIAamp MinElute cf-DNA 试剂盒显示出更高的变体等位基因频率[30]。有研究[31]比较了11 种提取cf-DNA的方法、3 种定量方法和2 种建立DNA 完整性的测定方法，发现QIAamp CNA kit 和the Norgen Plasma/Serum Circulating DNA kit 可作为更好的选择。另外研究[32]对七种市售的cf-DNA 提取试剂盒进行评估，发现QIAamp CNA kit 可提供最高的cf-DNA 产量和部分低分子量。

2.3 血浆cf-DNA的检测方法 目前cf-DNA 检测方法有甲基化特异性PCR 法、聚合酶链反应-单链构象多态性分析法（PCR）、TaqMan 探针法、DNA 序列测序法、微滴式数字（ddPCR)等。cf-DNA 分析的进展高度依赖于技术进步，因为需要用高度敏感的技术将样品中突变或甲基化等位基因的检测出来。在检测cf-DNA 中EGFR 突变的ddPCR 似乎比ARMS-PCR 有更高的敏感性，特别是在早期[33]。ddPCR 技术检测ct-DNA 具有高灵敏度和特异性，该检测可用于准确的疾病监测，耐药性突变的鉴定以及实体瘤患者前期治疗的评估[34]。随着ddPCR 技术的发展和优化，目前ct-DNA的检出限可低至0.001%，准确度高，为ct-DNA的临床应用开辟了广阔的空间[35]。

3 cf-DNA 在乳腺癌中的应用

3.1 早期诊断和筛查 cf-DNA 检测是一种快速、实时、低成本、非侵入性的肿瘤基因检测方法，可以在乳腺癌基因水平进行早期诊断、筛查、鉴别诊断。肿瘤是由癌基因、肿瘤抑制基因和/或DNA 稳定性基因的遗传和表观遗传变化的积累引起的，DNA 甲基化是早期癌变的表观遗传学标记物，可成为筛查和早期诊断癌症的标志物[36]。DNA 甲基化是由DNA 甲基转移酶（dnmts）催化，甲基（-CH3）共价转移到CpG 二核苷酸中胞嘧啶环的第五个碳，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）[37]。高甲基化的启动子造成抑癌基因失活是肿瘤发生的共同特征，肿瘤中低甲基化发生在基因组中是一种常见现象[38]。在乳癌患者的血浆样本中，可检测到BRCA1、RASSF1A 和GSTP1 基因中至少有一个基因的启动子甲基化[39]。DNA 甲基化特征、遗传风险评分、环境风险评分的联合应用可以准确地预测乳腺癌的发生率，可用于高风险人群的筛查[40]。乳腺组织中含有丰富的5-羟甲基胞嘧啶基因组位点，并提供了正常乳腺组织中核苷酸水平5-羟甲基胞嘧啶的全基因组图谱[41]。RARB2、DAPK、hMLHI、p14 和p15的高甲基化均会增加乳腺癌的易感性[42，43]。在雌激素受体阳性乳腺癌的发展过程中，miR-190b的上调可能通过启动子DNA 甲基化的缺失而发生，miR-190b的低甲基化导致LuminalA 亚型乳腺癌特异性生存率的增加[44，45]。BRCA1 和BRCA2 突变携带者cf-DNA 水平明显高于非携带者，这一发现有助于高危妇女早期发现乳腺癌/卵巢癌[46]。乳腺导管癌组的FHIT 基因ct-DNA 甲基化水平非常高，有助于乳腺导管癌的早期诊断[47]。cfDNA的甲基化评估可以同时筛查乳腺癌、直肠癌和肺癌[48]。以上这些研究为乳腺癌的cf-DNA 检测提供了靶点，未来的研究可以用这些靶点对乳腺癌进行早期诊断和筛查及鉴别诊断。但cf-DNA 在乳腺癌的早期诊断和筛查也存在不足。作为一种生物化学检测方式，cf-DNA 在乳腺癌检测中如何优化最佳靶点、提升特异度和敏感度、提高准确率等都是需要解决的问题。

3.2 疗效和预后评估 病理检查是诊断肿瘤“金标准”。但病理检查是一种高侵袭性、昂贵且耗时的方法，不适用于少量的肿瘤组织或疗效检测以及肿瘤的预后评估。血清cf-DNA 水平及其完整性可作为乳腺癌的辅助诊断、肿瘤分级和预后评估的生物标志物[49，50]。测序技术对乳腺癌患者血清cf-DNA的检测具有足够的稳定性和特异性[51]。另外血清样本可长期保存，在监测乳腺癌预后方面具有重要作用。检测总cf-DNA 水平是评估转移性乳腺癌患者总生存率和无进展生存率的良好预测指标[52]。在转移性乳腺癌患者中，接受治疗后患者的cf-DNA 浓度降低，cf-DNA 完整性增加。cf-DNA 变量组合可以作为转移性乳腺癌患者在基线和第一个系统治疗周期后的独立预后标志物[53]。cf-DNA 肿瘤率阈值≥10%与三阴性乳腺癌转移患者生存率显著降低相关[54，55]。高cf-DNA 突变负荷与较低的无复发生存率相关，cf-DNA 中肿瘤特异性体细胞变体的存在与较差的无复发生存率相关[56，57]。总之，cf-DNA检测可以反复进行，在监测乳腺癌分子进化、治疗效果及预后评估方面有着独特的优势。

4 总结

乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤之一，早期无创诊断对降低癌症相关死亡至关重要。cf-DNA 在乳腺癌早期诊断和筛查、疗效检测、预后评估等方面的应用还面临着诸多问题，需要进一步深入研究。作为一个具有潜在价值的生物标志，相信随着研究的不断深入，cf-DNA 在乳腺癌中的作用会逐渐被揭示并最终应用到临床。