自组装多肽在医学领域应用研究进展

张峻恺综述 汪健审校

随着组织工程技术的快速发展，利用自组装多肽作为支架材料与组织活体细胞进行结合，能很好地充当起细胞外基质的代替作用。作为生物领域材料的最新研究成果，它具有良好的材料—细胞界面的相容性、可降解性等特性而备受关注。

1 自组装多肽概述

自组装多肽具有良好的生物相容性和生物降解性，通过合理调控多肽的分子结构及改变外界的环境，多肽分子可利用非共价键作用力自组装形成纳米纤维结构，进而形成水凝胶。天然或者合成的肽及其偶联物的自组装纳米结构具有精确的选择性和多功能等优点，并且由于其在能源、生物医学和纳米技术方面的巨大应用潜力而引起了人们的极大关注。由氨基酸组成的多肽是最受欢迎的构件和可编程的分子基序之一。利用多肽组装的纳米结构和材料由于其生物友好性和可逆性，在绿色生命、新技术和生物医学应用方面显示出重要的潜力。自组装多肽是一类越来越受欢迎的生物学材料。作为最受生物启发的构件，多肽在新出现的纳米技术和生物医学中的先进材料和应用方面引起了越来越多的关注[1]。当前自组装多肽的纳米颗粒已经成为生物医学应用的强大工具，尤其是在骨、神经血管再生中的应用，并且可以诊断出微小的器官病变，使疾病的预防成为可能[2]。

2 自组装多肽的结构与特性

氨基酸之间的相互作用使复杂的自组装纳米结构得以发展。自组装多肽包括短氨基酸序列或重复氨基酸序列的单体组装成的纳米结构肽组装体，表现出独特的物理化学和生化活性。肽可以设计成具有特定性质的不同超分子纳米结构。经过设计的具有α-螺旋或β-折叠二级结构的多肽和两亲性肽单体在自组装成超分子组装方面显示出很好的前景[3]。多肽的自组装是通过范德华、静电、氢键作用和π-π堆积作用使分子利用自由能驱动的过程自发地组织成有序结构[4]。因此，氨基酸的不同性质可在肽的设计中进行操纵，以启动自组装，从而产生新的功能生物材料。生物分子的自组装是指在没有外源引导的情况下，通过自下而上的方法及非共价相互作用将其结合成有序的三维结构的能力。自组装在自然系统中普遍存在，并且是在活细胞中产生如DNA双螺旋和蛋白质折叠，与各种非共价相互作用有关。自组装在自然界中是一个重要的过程，多项研究在创造增强型生物医学材料方面利用了这种过程[5]。肽自组装作为一种制备方法，具有各种构象，如α-螺旋和β-折叠。可以用于制造从纳米尺度的纳米管到宏观尺度的纤维束等各种结构[6]。在α-螺旋到β-折叠的二级结构转变对于通过抑制β-折叠聚集来治疗神经系统疾病和在细胞外基质中应用α-螺旋纤维如三链胶原、药物传递和控制释放及组织工程都具有重要的意义[7]。

3 自组装多肽在再生医学中的应用

3.1 骨与软骨 创伤性骨缺损与退行性关节软骨缺损需要修复，组织工程的出现，不仅给骨缺损和软骨缺损的再生提供了很好的生物相容性支架，而且还为细胞分布和细胞外基质(ECM)积累提供模板。自组装多肽是一种人工合成的生物材料，并且具有与细胞外基质相类似的的纳米纤维结构，使用自组装多肽水凝胶可以最大限度地减少生物污染的风险和不确定因素的影响，骨形成所必需的因素包括成骨细胞等细胞，自组装多肽水凝胶是可以支持这些细胞黏附和移动的细胞外基质[8-9]。作为一种新型可注射的生物材料，自组装多肽水凝胶具有以上成骨所需要的必要因素，已在实验中证实海藻酸钠与FmocFF多肽相结合的水溶胶具有诱导成骨分化和促进钙化的作用[10]。自组装多肽BMSCs-RADA16 复合体显著促进了小鼠成骨细胞的增殖、分化和迁移，并且在实验中也发现BMSCs-RADA16复合体的成骨基因表达显著提高[11]。将D-RADA16多肽水凝胶包裹在加入了碱性成纤维细胞生长因子的纳米人工骨上，不仅降低了水凝胶的降解率，还延长了bFGF的缓释时间，从而更好地促进骨愈合和保持良好的骨愈合性能[12]。另一项研究中使用SPG-178与PEEK组成混合支架，弥补了水凝胶强度的不足并且能够满足成骨要求，将其注入大鼠股骨缺损模型中，通过影像学验证，在缺损处新骨基质形成程度显著增高。在整个研究过程中，空洞的缺损基本上没有任何矿化组织，模型缺损的大小是临界的，即在研究的长度内无法愈合[13]。

骨髓间充质干细胞(MSCs)可在转化生长因子(TGF)诱导下并在颗粒培养中促进软骨形成[14]。一种多肽两亲性分子的共组装系统，该系统通过显示高密度的转化生长因子-β1(TGF-β1)结合表位来形成用于软骨再生的纳米纤维软骨的修复，体外实验表明，这些材料支持人骨髓间充质干细胞的存活并促进其向软骨细胞分化，而且在兔的软骨缺损模型中证实可以促进软骨的再生[15]。利用RADA-16肽的自组装合成水凝胶注入小鼠模型中观察到其结构有利于软骨细胞的嵌入和关节软骨的再生，并且伴随的炎性反应比非生物凝胶更低。由此说明自组装多肽水凝胶可用于组织再生的细胞培养支架[16]。

3.2 神经系统 由于神经细胞不能进行再生或再生能力极弱的特性，神经元组织的再生及其修复是困难的。在体内若神经受到创伤性损伤，神经细胞难以分化再生。

神经组织再生能力差，在创伤性脑损伤或神经退行性病变后可导致永久性脑损伤。但组织学工程出现给神经损伤带来了治疗策略。在过去的几十年里，干细胞在脑外伤治疗中的应用引起了人们极大的兴趣。移植各种人类干细胞作为自体细胞来源，种植在纳米支架中，可改善不同神经系统损伤动物模型的脑结构修复和功能恢复[17-18]。神经干/祖细胞(hNS/PC)和人脂肪间充质干细胞(hADSCs)、人脑膜瘤干细胞具有增殖和分化为神经元和胶质细胞的潜能。在大鼠急性创伤性脑损伤模型中，自组装多肽纳米纤维支架——RADA4GGSIKVAV(R-GSIK)，将人脑膜瘤干细胞种植到该支架中，并将含有人脑膜瘤干细胞纳米纤维支架移植到创伤性脑损伤的动物模型中，减少了损伤部位炎性反应过程和反应性胶质增生，减少了细胞凋亡，显著改善了脑功能的恢复[19]。将癫痫患者脑来源的hNS/PC和hADSCs种植在PuraMatrix水凝胶(PM)中，并在脑损伤大鼠模型中证实可促进脑外伤大鼠功能恢复，减少病灶体积，抑制炎性反应，减少损伤部位的反应性胶质增生，是一种可用于神经疾病(如顽固性癫痫)的潜在细胞治疗[20]。

在脊髓损伤后会形成充满液体的嚢腔并且出现炎性反应和形成胶质限制了神经再生。但利用多肽纳米纤维之间的结构微环境与电荷诱导的作用，并加入生长因子，实现了可持续释放生长因子，这种人造的生物微环境诱导了轴突的再生并调节了局部的炎性反应[9]。不论是体内还是体外实验，将微血管细胞移植到自组装多肽RADA16-I中，在肽支架内都形成了紧密连接的血管系统，从而产生了血—脊髓屏障。并观察到移植或损伤部位的轴突密度增加，证明其在治疗脊髓损伤中的潜力[21]。自组装多肽凝胶SPG-178在体外可促进运动神经元突起生长，增加NGF、BDNF、NT-4、TrkA和TrkB的表达，在体内应用SPG-178可减少炎性反应和胶质瘢痕形成，为SPG-178作为支架通过诱导神经保护因子治疗脊髓提供了新的证据[22]。

周围神经迅速再生才能恢复神经和肌肉的功能，所以周围神经再生也备受关注。干细胞是周围神经系统的主要支持细胞，在轴突再生中起着重要作用。一项选择大鼠干细胞作为研究对象评价细胞在不同支架上的黏附、增殖和功能基因表达模式研究表明，具有仿生细胞识别功能的多肽共电纺支架植入纳米结构对干细胞的增殖功能具有积极作用，这些支架随后可通过促进轴突再生和功能性神经恢复来修复周围神经缺损[23]。另一项研究使用RADA16-I多肽作为支架，并将脑源性神经营养因子(BDNF)衍生的神经营养肽(RGIDKRHWNSQ)引入RADA16-I的C末端，得到了RAD-RGI功能化自组装多肽水凝胶。大鼠坐骨神经损伤模型研究表明，功能化多肽RAD/RGI水凝胶不仅为轴突再生和支持胶质细胞生长提供了适宜的微环境，而且有协同促进周围神经功能恢复的作用[24-25]。

3.3 心血管系统 在血管组织工程中，增强内皮细胞的活性，如黏附、排列、生长和分化，是血管再生成功的关键目标。多功能自组装多肽在血管组织再生中也是有效的，可作为支架影响细胞的排列、黏附和分化，并促进更好的内皮化[26]。血管内皮生长因子(VEGF)是一种众所周知的生长因子，在血管生成中具有重要作用。利用人骨髓间充质干细胞(hMSCs)与人脐静脉内皮细胞(GFP-HUVECs)在细胞黏附配体RGDS功能化的自组装多肽(PA-RGDS)两亲纳米基质上共培养，结果表明PA-RGDS纳米基质与hMSCs共培养时VEGF基因表达上调，VEGF分泌增加，呈网状结构，提示hMSCs与HUVECs和PA-RGDS协同作用促进血管生成[27]。Qi等[28]设计并合成了一种新的糖肽分子，并使其转化为糖肽透明的水凝胶(即GP凝胶)，掺入促血管生成因子(DFO)，自组装的GP凝胶在体外可作为可持续释放DFO和诱导内皮细胞毛细血管形态发生的储存库。在动物模型中包裹DFO的自组装GP凝胶可在体内触发新的毛细血管生成。在临床中，心肌梗死可造成心肌损伤，而心肌细胞再生能力有限，但心脏组织工程的出现，让人们看到了其潜在的能力。以往研究表明，自组装多肽可注射至心肌中来创造三维微环境，在微环境中血管平滑肌细胞被募集，并可能形成功能性的血管结构，并且注射的三维支架在心肌内组装成体内的微环境不会导致主要的炎性反应[29]。目前在大鼠心肌梗死模型中将RADA-SDKP自组装多肽水凝胶注入其中作为细胞支架载体，之后在模型中观察到微血管的扩张再通，大鼠左心室射血分数(LVEF)明显改善[30]。通过将来自血管生成素-1的生存肽QHREDGS连接到已知的自组装多肽 RADA16-I上，所形成的多功能自组装多肽——DSAP,将MSCs移植到DSAP中并注入至大鼠心肌梗死模型中，结果表明DSAP-MSC注射液能改善心功能，减少梗死面积、胶原含量和细胞凋亡[31]。综上，自组装多肽的一个强大优势是，它们可以被设计成整合生长因子和其他信号，这些信号为治疗心血管系统疾病提供了新的途径和策略。

4 自组装多肽在癌症治疗中的前景

化疗是一种较为成熟的传统癌症治疗方法。但化疗药物非选择性对于健康细胞也会造成一定的损害，为了将非选择性不良反应降到最低，化疗中可使用特定的肽序列或基序。设计成纳米粒子的肽在化疗中用于靶向癌细胞表面或肿瘤血管，可将全身药物不良反应降至最低，并提高效率。作为药物载体，自组装多肽具有许多优点，如载药效率高，药物损失率低，稳定性高，避免了体内清除[32-33]。

肿瘤组织中的细胞过程如生存、增殖、转移，在这些细胞过程中肌动蛋白骨架作用是至关重要的。根据这一机制可以设计出针对破坏肌动蛋白细胞骨架的靶向分子组合体，可特异性地靶向和破坏肿瘤肌动蛋白细胞骨架，通过其在癌细胞膜上所形成的纳米结构域，可选择性地针对多种类型癌细胞。其机制是通过肌动蛋白细胞骨架实现下游癌细胞的滞留，有效抑制了癌细胞的侵袭和转移，从而达到肿瘤的治疗作用[34-35]。可转化肽——BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV可在一定条件下组装成纳米颗粒，与癌细胞上的表皮生长因子受体(HER2)结合后转化为纳米纤维并阻止了下游细胞信号传递及细胞核中增殖和生存基因的表达，这些基于结构转化的超分子肽代表了一类受体介导的抗癌靶向纳米疗法[36]。

在乳腺癌治疗中光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)，表现出空间选择性高、非侵袭性和耐药性可忽略不计等优点，Wan等[37]将TAT肽与具有PTT和PDT抗癌功效的近红外荧光染料——IR780偶联，形成TAT-IR780 并与化疗药物阿霉素(DOX)在水介质中形成TID纳米颗粒，TID纳米粒子具有良好的肿瘤穿透能力，能有效地将IR780和DOX导入癌细胞，并且可有效地介导IR780和DOX的协同抗癌作用。另一种多功能肽P51与化疗药物吡柔比星(THP)自组装形成P51-THP纳米粒，并且已证实该纳米颗粒在达到肿瘤组织之前其传递系统是完整的，完整的P51-THP纳米粒在体内很难进入细胞核，有利于减少化疗药物的毒副作用，并且肿瘤微环境的多重释放触发器可能通过增加药物释放而在肿瘤靶向治疗中发挥关键作用[38]。P51-THP与TID纳米颗粒就是化疗药物与多肽结合所形成的药物输送纳米颗粒，并且其可靶向性地将化疗药物导入癌细胞发挥抗肿瘤效果，同时降低了化疗药物的全身毒性，这种将化疗药物与多肽结合并靶向性输送至癌细胞中是治疗癌症的一种潜在疗法。

在肿瘤的诊断上，一种成纤维细胞激活蛋白-α(FAP-α)反应肽的近红外探针可在肿瘤相关成纤维细胞(CAF)表面特异性地原位形成纳米纤维，注入后可造成CAF的蓄积和滞留，提高了成像灵敏度，可获得2 mm小肿瘤的近红外成像，给NIR、MIR、PET/CT等提供了一种可扩展的成像探针设计，有助于提高肿瘤诊断能力[39]。

5 自组装多肽的其他用途

目前已经出现了许多多重耐药微生物，给人类的健康及经济增加了许多的负担，但抗菌肽的出现给这一问题带来了希望。抗菌肽已经被认为是对抗耐药微生物的新武器，其具有良好的广谱抗菌活性和抗生物膜能力。以革兰阴性大肠杆菌、革兰阳性金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为例，不同结构的多功能自组装抗菌肽对其都有抗菌性和抗生物膜性，甚至有的抗菌肽还表现出比抗生素更好的抗菌效果[40]。

血脑屏障是在药物给予过程中遇到的一项最具有挑战性的生物膜，它不仅阻止了有害物质进入大脑，同时也阻止了治疗药物的进入。随着自组装多肽的发展，研究人员将细胞穿透肽HIV-1反式激活转录子(TAT)进行组装，该肽被认为可以穿透细胞的质膜，这表明它可作为载体运送药物。并且将TAT肽与两性离子纳米凝胶偶联形成TAT-nBSA纳米颗粒，并证实了其可用于血脑屏障的跨越[41]。另一项研究中，二苯丙氨酸纳米组装体完全抑制细菌生长，其作用机制是引起膜渗透和去极化，对细菌形态造成实质性破坏。

RADA16自组装多肽水凝胶用于抗菌阳离子肽(AMPs)的递送外，体外研究表明，这种新型自组装水凝胶能促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖，抑制金黄色葡萄球菌的生长及可以释放到治疗后28 d[42]。Liu等[43]设计了一种两亲性短肽(CG3R6TAT)，它包含一个细胞穿透肽TAT的亲水块和6个精氨酸残基(R6或Arg6)及一个疏水性的胆固醇(C)块，并且证实此纳米颗粒对细菌、耐药细菌、酵母和真菌都有很强的抗菌效果，并且在兔脑膜炎模型中验证该肽纳米颗粒能够穿过血脑屏障，并抑制脑部细菌的生长，重要的是，它们不会对主要器官造成明显的毒性，表明这些纳米颗粒可能在治疗脑部感染方面提供一种有效的抗菌剂。这些研究结果证实了自组装抗菌构件的重要性，并且引发了人们对抗菌剂和生物材料的关注，为抗菌药物和生物材料的结合提供了方法和设计原则。

6 自组装多肽应用中优缺点

自从自组装多肽水凝胶被发现并在组织工程中应用以来，其具有以下几个特点[44-45]：(1)其自身拥有天然的氨基酸成分且是一种纳米结构材料，具有很好的功能材料特点；(2)溶于无菌离子水后所形成的水凝胶既可以注射并又可在蛋白酶中完全降解，大大降低了异物排斥反应；(3)自组装多肽是一良好的生物学材料，较其他传统材料相比具有更好的生物相容性，并且具有更好的细胞生存三维结构；(4)自组装多肽的片段可以适当的调整成为所需要的纳米纤维功能材料，自组装多肽在骨再生医学的应用时，对于小面积的组织缺损有很好的功能支撑作用，但在面积较大的缺损和/或承载骨缺损时其功能支撑作用并不理想[45]。

7 结论与展望

自从自组装分子这一概念提出来以后，近几十年内科学家们对这一领域产生了浓厚的兴趣，通过多学科的共同努力，自组装多肽可以帮助研究复杂的生物现象，创造各种应用。在体内动物模型及体外培养实验都得到了许多令人兴奋的发现，显示了其在人体组织修复方面的巨大潜力。组织工程的进展十分迅速，但仍有一些困难需要去攻克，如在具有三维结构水凝胶的机械化不是很稳定。另外，对这一新型生物材料来说，如何设置其全面的监测系统，如自组装多肽与其他材料或药物的整合中，在组织再生中能控制其修复及损伤的靶点，需要人们积极地寻求新的治疗方法，例如是否能在一种主要修复骨再生多肽上加其他具有不同功能的多肽小片段和/或生长因子，使其具有成骨的特性及其他特性(如成血管等)，使其成为一个复合体，这样在运用于组织再生时具有可控的生物靶向特点。这些困难和挑战将推动该领域的发展。