外泌体在脑胶质瘤中的研究进展

谈胤求综述 陈谦学审校

外泌体是直径在40～120 nm之间的膜性囊泡，可被细胞摄取及分泌[1]。研究表明，外泌体内包含具有生物活性的RNA及蛋白质，能够通过外泌体进行细胞间的转移，从而发挥相应的生物作用[2-4]。越来越多的研究证实，在众多癌症中，外泌体内特定物质(miRNA和/或蛋白)的改变与癌症的发生、发展及预后相关[5-8]。文章将对外泌体的构成、起源、功能及其在人脑胶质瘤治疗中的作用进行综述。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的构成 在电子显微镜下可观察到外泌体是具有脂质双层结构的半球形结构[9]，在外泌体的水囊内和膜上包含很多核酸、蛋白质，根据外泌体细胞来源的不同，其表面还含有许多不同的受体。外泌体中存在许多类型的蛋白质，包括与细胞间膜融合相关的膜联蛋白和ras相关GTP结合蛋白(RAB蛋白)，与信号转导相关的蛋白激酶和异源三聚体的G蛋白，有与代谢相关的酶如过氧化物酶、脂质激酶和烯醇酶-1，还有与抗原提呈相关的热休克蛋白HSP70和HSP90[10]。另外四分子交联体家族成员也是外泌体中含量丰富的蛋白，包括CD9、CD63、CD81和CD82，它们可与主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)分子及整合素发生相互作用[11]。

1.2 外泌体的形成 外泌体的形成主要有2个步骤，首先是来源于内向萌芽的部分内体膜，其包裹着细胞合成的蛋白与核酸等物质，形成管腔囊泡(intraluminal vesicles)，外泌体中也发现了识别胞质蛋白的抗体，如HSC70[12]。之后，多个管腔囊泡共同形成多胞体(multivesicular body，MVB)，部分多胞体能够暴露出胞质的转膜蛋白结构域，从而与细胞质膜融合，形成外泌体向胞外释放，剩下的则被溶酶体降解[13]。

1.3 外泌体的分泌 外泌体通过晚期内吞作用的间室与质膜融合的形式分泌到胞外，这种融合是细胞中最基本、最普遍的形式。而在T细胞和肥大细胞中，这种融合则需要依赖钙离子才能激活[14]。目前对于这种融合的分子机制研究甚少，大部分细胞内膜的融合发生都由特定的蛋白机制所决定，比如可溶性因素，其中包括N-乙基马来酰亚胺敏感的因素(NSF)、可溶性NSF黏附蛋白(SNAP)，以及膜复合物因素，比如SNAP黏附蛋白受体(SNARE)。发生融合的2种膜需要具有相应的SNARE，即囊泡SNARE(v-SNARE)和目标SNARE(t-SNARE)[15-16]。另外外泌体的分泌还受到Rab27a和Rab27b的控制，抑制这两种Rab27的受体：突触结合蛋白样4(synaptotagmin-like 4)和EXPH5(exophilin 5)能够抑制外泌体的分泌[17]，但是最近又有研究显示，敲除PC-3中的Rab27b能够增加外泌体的释放[18]。目前还不清楚外泌体分泌的具体调节机制，上述相关分子在外泌体分泌中发挥的作用也仍需进一步探究。

1.4 外泌体的功能 外泌体可以从不同类型的细胞中释放出来，能够通过转运脂质、蛋白及核酸到接收细胞来调节细胞的生物活性。在免疫应答、肿瘤进展及神经退行性改变等过程中，外泌体都发挥着重要作用。在抗肿瘤T细胞免疫应答方面，外泌体也参与了MHC的抗原呈递过程[19]。在肿瘤进展方面，胰腺癌PANC-1细胞来源的外泌体不仅能够分泌Wnt5b，促进肿瘤增殖与迁移，而且这种现象还在肺癌及结肠癌细胞系中存在[20]。在血管生成方面，内皮细胞分泌的外泌体富含血管内皮生长因子(VEGF)，可以刺激邻近肿瘤血管的生成[21]。然而对于外泌体生物学功能的具体分子机制仍不明确，其作用可能受其被分泌和摄取及复杂的内容物等因素影响。

2 外泌体与脑胶质瘤

2.1 脑胶质瘤的发生进展 由于外泌体本身包含许多核酸、蛋白，而且可以在细胞间进行交换，因此其可被利用为生物载体，去影响特定的细胞或分子。在胶质瘤中，外泌体也同样能够通过转运其内含物到胶质瘤细胞中，从而影响胶质瘤的生长[22]。胶质瘤释放的外泌体能够激活糖酵解通路，从而使间充质干细胞表现出肿瘤样生长[23]。级别越高的胶质瘤，其释放的外泌体含量越多[24]。胶质母细胞瘤干细胞来源的外泌体含有Notch1蛋白，通过激活Notch1信号通路使非干细胞性胶质瘤的干细胞性和成瘤能力增加[25]。另外，胶质母细胞瘤血清循环外泌体中的miRNA-148a水平更高，抑制miRNA-148a能够抑制STAT3通路从而抑制胶质母细胞瘤的增殖和转移[26]。同时，骨髓基质细胞分泌的含有miRNA-375的外泌体也能够通过抑制SLC31A1从而抑制胶质瘤进展[27]。这些结果表明，外泌体与胶质瘤之间存在非常复杂的作用关系，特定来源的外泌体能够影响胶质瘤的发展。

2.2 脑胶质瘤的诊断 液体活检是一种快速、廉价的获取肿瘤相关信息的方法，并且采集方便[28]。利用肿瘤分泌的外泌体可作为功能性生物标志物。在临床实践中利用肿瘤来源的外泌体和相关核酸及蛋白的分析也有助于以非侵入性的方式建立诊断[29]。理想的生物标志物具有为各种临床应用提供重要信息的潜力，如能够进行疾病进展的早期检测，肿瘤的分子亚型分类及预测对治疗可能发生的反应。在胶质母细胞瘤中鉴定此类生物标志物将实现基于分子水平的检测方法，对患者组织活检和肿瘤进展的MR评估进行补充。MR的特异度范围在50%～80%之间，通常能区分胶质母细胞瘤与其他颅内病变，但已被证实可能错过早期病变，其分辨率极限为2～3 mm[30-31]。MR在评估早期肿瘤进展中具有显著的局限性。目前，一些含特定蛋白或RNA的外泌体已被鉴定为神经胶质瘤特异性生物标志物，包括EGFR、IDH1和miRNA-21[32]。miRNA-21是已知的EGFR表达调节因子，所有胶质母细胞瘤患者的脑脊液中均可以检测到，是胶质母细胞瘤检测的高敏感度标志物[33]。除了用于胶质瘤的诊断，miRNA-21、miRNA-222及miRNA-124-3p还可以用来区分肿瘤假性进展和真性复发[34]。因此，在血液、脑脊液和其他体液中检测特异性肿瘤标志物，对胶质瘤的诊断及肿瘤进展的监视也具有重要意义[35]。虽然从脑脊液、血液和尿液中提取外泌体非常方便，并且创伤小，但是哪种体液的准确性更高，或是否需要联合使用多种体液进行诊断，目前还没有定论。

2.3 脑胶质瘤治疗价值

2.3.1 脑胶质瘤化疗：外泌体可以作为肿瘤对临床治疗敏感性的生物标志物。O-6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)是一种能够修复替莫唑胺处理引起DNA损伤的酶。研究显示，MGMT的启动子DNA甲基化能够降低细胞中特定核蛋白的表达，从而增强替莫唑胺对胶质母细胞瘤患者的疗效。22%～57%的胶质母细胞瘤患者能够检测到MGMT启动子区的甲基化，而利用免疫磁性外泌体RNA分析患者血清发现，在表现为耐药的患者中，经过替莫唑胺治疗后外泌体信使RNA表达水平升高[36-37]。胶质瘤细胞能够刺激正常人星形细胞转变成反应性星形细胞，而反应性星形细胞能够释放含有更多MGMT信使RNA的外泌体，这些外泌体被MGMT阴性的胶质瘤摄取后便可获得替莫唑胺抵抗能力[38]。在替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞分泌的外泌体中，miRNA-2138表达明显升高。这种由耐药胶质瘤分泌的含miRNA-2138的外泌体被替莫唑胺敏感的胶质瘤细胞摄取后也能获得耐药性[39]。另一项研究发现，胶质瘤外泌体的miRNA-221同样能够影响肿瘤对替莫唑胺的敏感性[40]。其他分子的表达也可以提供标志物的间接定量，包括miRNA-603和miRNA-181d，其表达与MGMT表达水平直接相关[37]。因此，可以在治疗期间监测以跟踪了解患者对治疗的反应。

2.3.2 胶质瘤免疫治疗：外泌体可以调控免疫系统以识别选定的肿瘤相关突变或抗原，形成免疫治疗方法的基础，尽管神经胶质瘤细胞可以利用血脑屏障部分地逃避免疫应答，但免疫疗法为胶质母细胞瘤患者提供了一种有吸引力的治疗方法，因为它们往往被免疫抑制，这种方法同时针对特定的肿瘤细胞群，也可以增强其免疫系统。与化学疗法或放射疗法不同，免疫疗法能够潜在地靶向肿瘤细胞，同时保留非肿瘤细胞。最早Zitvogel等[41]观察到在肿瘤多肽存在下孵育的树突细胞会释放外泌体，刺激细胞毒性CD8+T淋巴细胞并抑制鼠模型中肿瘤生长。进一步研究揭示树突细胞来源的外泌体(dendritic cell derived exosomes,DCDE)表达MHCⅠ类和Ⅱ类，其允许外泌体将非自身蛋白的肽片段展示给细胞毒性T细胞。DCDE在其脂质双层中也含有CD63，这是一种共刺激蛋白，有助于在抗原呈递过程中引导T细胞[42]。因此，树突状细胞也被用作疫苗，对胶质瘤进行免疫治疗[43]。作为细胞间通信和免疫功能的焦点介质，外泌体可以对包括B淋巴细胞、T淋巴细胞和单核细胞的免疫细胞发挥作用[44]。这为外泌体提供了增强调理作用，调节抗原呈递，诱导免疫激活和改变免疫抑制的能力[45]。通过检测外泌体中的蛋白及RNA还能反映出胶质瘤患者对于抗肿瘤疫苗使用的效果[46]。而胶质瘤干细胞自身分泌的外泌体则能够促进肿瘤的免疫逃逸[47]。然而，有文献报道，胶质瘤来源的外泌体在免疫抑制上的能力很有限，仅观察到了免疫抑制的HLA-DR的单核细胞表型，但是并没能诱导PD-L1的表达及细胞毒性T细胞的激活[48]。胶质瘤的免疫逃逸可能还涉及其他机制，但是外泌体在胶质瘤免疫治疗中的作用正在不断被挖掘。

2.4 胶质瘤预后评估 胶质瘤的预后与多种因素相关，其中包括患者年龄、肿瘤级别、肿瘤分子病理分型等。而胶质瘤外泌体的含量不仅与肿瘤级别呈正相关，还与预后呈负相关[24]。同样的，外泌体中的miRNA不仅可以用来进行诊断和治疗，还可以预测患者预后。研究表明，血清外泌体miRNA-301a、miRNA-30a-5p及miRNA-210低水平组的生存率较对应的高水平组更高[49-51]。另外，血清外泌体的miRNA-181b含量越高，患者的术后存活时间就越短，并且还提示患者有更差的功能结果及肿瘤相关并发症发生[52]。而利用血清外泌体中的HOTAIR水平也可预测胶质母细胞瘤的预后，并且准确度和敏感度都较高[53]。通过生物信息学分析及临床标本验证也发现，血清外泌体的miRNA-210、miRNA-449及miRNA-5194均与胶质瘤的级别、诊断、侵袭及预后相关。未来通过更加深入地对外泌体的研究可能发现更多针对胶质瘤预后的敏感度和特异度都极高的分子。

3 小结与展望

已知外泌体与其他细胞外囊泡一起作用于供体和受体细胞的长距离通信，以递送许多分子和分子信息。研究表明，外泌体可参与许多基于肿瘤发生发展过程的调节，并且影响肿瘤对免疫和药物的反应。肿瘤细胞分泌的外泌体不仅可以促进肿瘤自身的生长，还能够通过影响瘤周微环境促使正常细胞向有利于肿瘤生长的方面改变，如内皮细胞血管生成增加等。通过检测、调控胶质瘤来源的外泌体可能会给胶质瘤的诊断和治疗带来突破性进展。然而外泌体领域的研究尚不深入，特别是在胶质瘤方面的研究还处于起步阶段。未来更全面地了解外泌体将会给胶质瘤乃至其他肿瘤的治疗带来新的希望。