卡介苗在非肌层浸润性膀胱癌灌注治疗中的研究进展

肖云飞，白云金，王佳豪，尹 山，王 佳

(四川大学华西医院泌尿外科，泌尿外科研究所，四川成都 610041)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一，70%～80%的膀胱癌局限于黏膜(Ta)或黏膜下层(T1)，即非肌层浸润性膀胱癌(non-muscular invasive bladder cancer,NMIBC)，一般通过尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)可完全切除，但由于其有很高的复发和进展风险，常需要辅助膀胱内化疗和或卡介苗治疗[1]。现卡介苗(bacille calmette-guerin，BCG)灌注治疗依旧是NMIBC患者治疗的金标准，近5～10年，BCG用于NMIBC的治疗进行了大量研究并取得了进展，本文就关于NMIBC的BCG免疫治疗做一综述。

1 BCG及其机制

BCG是牛分枝杆菌的减毒活菌株，研发后主要被作为结核病疫苗而大量应用。后期研究发现BCG可降低TURBT后复发和NMIBC进展的风险。1990年，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准BCG膀胱内注射可用于中高危NMIBC患者，迄今为止一直被用于临床。虽然BCG治疗NMIBC的机制还不完全清楚，但目前认为很大程度上与细胞免疫机制有关[2]，主要包括CD4+T细胞刺激和诱导辅助性T细胞(Th)1型免疫反应。

BCG抗原直接作用于尿路上皮细胞表面后，尿路上皮细胞通过使MHC Ⅰ类表达增加，将抗原呈递给BCG特异性的CD4+T细胞，激活局部免疫系统，释放促炎性细胞因子。其通过诱导已激活的巨噬细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞和其他效应细胞在膀胱壁聚集，增强机体对肿瘤细胞的识别，从而产生了一种以Th1介导为主的细胞诱导免疫，通过各种免疫机制对膀胱肿瘤细胞产生细胞毒性，增强抗肿瘤作用。其中包括先天性免疫和获得性免疫，但哪种免疫起主导作用目前仍存在争议[3]。一项研究发现，无论是在膀胱肿瘤内还是与正常膀胱壁交界处，CD4+T和CD8+T细胞的数量都相对较少；而在BCG灌注治疗后，该处的CD4+T和CD8+T细胞浸润数量明显增加，抗肿瘤反应增强[4]。这也证实了细胞免疫在BCG治疗NMIBC中扮演着十分关键的作用。近几年来已确定了几种细胞因子参与了这一应答，包括白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α、干扰素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF)。此外，许多研究发现BCG对尿路上皮肿瘤细胞还具有重要的抗增殖作用[5]。

2 BCG治疗的疗效及其影响因素

2.1 BCG治疗NMIBC的疗效2020年3月，欧洲泌尿外科学会(European Association of Urology,EAU)发布的NMIBC诊疗指南指出，在预防肿瘤复发与进展方面，TURBT后BCG治疗效果明显优于单纯TURBT或TURBT加膀胱内化疗，同年美国泌尿外科协会(American Urological Association AUA)与泌尿外科肿瘤协会(Society of Urologic Oncology，SUO)发表的NMIBC诊疗指南也赞同该观点[6]。许多研究证实，NMIBC患者经BCG灌注治疗后，复发和进展的长期风险会明显降低，然而是否影响癌症特异性死亡率(cancer-specific mortality,CSM)，现目前仍无定论[7]。其中，在预防有高复发风险的NMIBC患者复发上，维持至少1年的BCG治疗比化疗更有效。

2.2 影响BCG疗效的因素用BCG免疫治疗NMIBC患者时，其疗效受到多种因素的影响。虽然之前认为不同BCG菌株的有效性和毒性没有差异。但现临床实践中发现，BCG不同菌株的潜在疗效具有差异性，而这种疗效差异性在BCG供应短缺时BCG的临床使用选择上具有很大的潜在价值和指导意义。

2.2.1不同BCG菌株对疗效的影响 一项纳入142例高危NMIBC患者的前瞻性随机研究比较了两种使用最广泛的BCG菌株：Connaught(加拿大)和Tice(美国)，对比了二者在肿瘤复发、进展、癌症特异性存活率和总体存活率(overall survival，OS)方面的差异。在BCG维持治疗时，Tice菌株的复发率更低；而无维持治疗时，结果恰恰相反，Connaught菌株的复发率更低。但是， D’ANDREA等[8]的实验表明BCG-Tice和BCG-Moreau(巴西)菌株治疗NMIBC时，无复发生存率(relapse-free survival,RFS)和无进展生存期(progression-free survival,PFS)没有差异。另外，不同的BCG菌株对于不同的膀胱肿瘤细胞的疗效也有所差异。研究发现，对于膀胱癌T24/J82细胞，相比于其他BCG菌株而言,Russian(俄罗斯)和Connaught BCG在细胞增殖抑制和细胞因子应答方面更有效[9]。但目前没有一项研究可明确何种菌株最优，因为这些实验研究大多仅使用了诱导治疗或研究样本太小缺乏数据证实；此外，这些研究均未采用统一研究标准，故没有绝对的说服力，需后期高质量研究证实这一问题。

2.2.2BCG剂量对疗效的影响 大量研究表明，对于中、高危NMIBC患者，小剂量BCG和全剂量BCG治疗具有相似的肿瘤结局[10]，其中中危NMIBC患者接受1年全剂量BCG治疗，高危患者接受3年全剂量治疗会更有效[11]；虽然小剂量BCG毒性最小，且OS略高于全剂量BCG治疗组，但需要再次TURBT手术的可能性较高，这对使用低剂量BCG治疗的优势提出了质疑[12-13]。随后有部分研究显示小剂量BCG组的疗效更低[14]。现目前认为病情恶化和复发率是选择BCG治疗最佳剂量的决定性因素，因此关于剂量大小是否影响疗效及BCG最佳剂量的选择仍未有统一定论。

2.2.3膀胱微生物群对疗效的影响 膀胱微生物群对于BCG治疗效果也有一定的影响。其可通过抑制IL-6、IL-8和NF-κB等途径来减轻黏膜炎症，因此可能会对依赖于局部炎症反应启动的BCG免疫疗法造成影响。但目前由于研究的样本较少，且使用的尿液中含有来自尿道末端的微生物污染，暂未得到普遍认可，因此需要进行更大规模的研究，以准确评估膀胱微生物组在膀胱癌进展和免疫治疗药物反应中的重要潜在作用。

2.2.4皮下注射BCG对疗效的影响 先前的实验发现，NMIBC患者BCG皮下与膀胱内同时注射后疗效不明显。然而之后的研究表明，在膀胱内BCG灌注之前皮下注射BCG，可加速T细胞进入膀胱并改善膀胱组织对BCG的反应，从而提高疗效；也间接证明患者具有BCG特异性免疫力与RFS的增加有关[15]。但之后有学者发现，这种治疗方法对一些NMIBC患者的免疫功能有抑制作用，因此可见BCG对不同个体的免疫学反应是不同的，具有可变的外显性[16]，后期应该深入研究，明确个体化治疗的具体方案。

2.2.5其他因素对疗效的影响 任何类型的免疫反应强度都会随着年龄的增长而下降，故在部分老年患者中BCG免疫刺激作用不足，其效果可能不佳，称免疫衰老[17]。但研究发现，年龄增长与BCG免疫治疗肿瘤的结果和预后无关，与BCG毒副作用也无关[18]。而膀胱癌患者可以从优化的管理中获益，可能是BCG免疫治疗成功的关键：如改变从TURBT到BCG灌注的时间、调整膀胱内灌注时使用的BCG剂量、BCG灌注间隔等，其中影响最大的可能是BCG灌注间隔。模拟实验表明，采用两倍于目前常规使用的7 d间隔时间，其治疗结果将会得到显著改善[19]。

另外，许多研究显示，与单独使用BCG相比，膀胱内序贯BCG和丝裂霉素C(EMDA-MMC)灌注治疗高危NMIBC可提高无病间隔时间，降低复发率和进展率，提高OS和无病生存率(disease-free sur-vival，DFS)。此外，免疫微环境中许多分子的表达水平也对BCG疗效有显著影响。NMIBC患者肿瘤程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的表达能抑制抗肿瘤T细胞从而减弱BCG治疗的免疫反应。因此不难看出PD-L1表达水平越高，影响越大[20-21]。另外，研究发现在BCG作用下，2型固有淋巴细胞(type-2 innate lymphoid cell,ILC2)产生2型细胞因子IL-13，从而介导单核细胞的募集和免疫抑制功能，所以通过刺激ILC2/IL-13轴提高疗效可能是增强BCG治疗NMIBC吸引力的一大靶点。

3 BCG联合免疫治疗

尽管BCG现已被多个指南推荐为NMIBC患者的首选免疫治疗方法，且可通过调控多种影响因素提高其疗效，但BCG在治疗过程中仍然出现了较多的不良反应。随着这些副作用的不断发现，我们开始认识到在正确的时间有针对性地给予适宜的联合免疫治疗很重要。而这将需要采用合理的组合方法，从而提高机体抗肿瘤能力。

基于已知局部固有免疫刺激和全身特异性免疫刺激具有协同潜力，因此尝试将局部免疫治疗与T细胞疫苗组合是可能有益的。实验证明，癌症疫苗(包括强佐剂)可以与BCG膀胱灌注治疗安全的结合，以增加膀胱T细胞和疫苗特异性T细胞，从而改善NMIBC患者预后。另一种联合方法则是通过局部应用选择性趋化因子或Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)激动剂来增加诱导T细胞的能力。先前有研究表明，在用佐剂多肽疫苗免疫的小鼠中，在阴道内或膀胱内单次注射不同的免疫刺激剂(CpG寡核苷酸、聚肌苷酸、聚胞苷酸，或减毒细菌，如沙门氏菌或BCG)可增强局部疫苗特异性CD8+T细胞免疫反应和肿瘤消退[22]。因此，在BCG中加入其他免疫刺激剂可以增加免疫反应，从而提高抗肿瘤效能。GM-CSF是BCG在促炎途径中的共刺激细胞因子，并且是刺激树突状细胞提呈抗原的有效因子。因此，NMIBC患者在接受以BCG为基础的膀胱灌注联合外源性GM-CSF时可增强促炎反应，对免疫应答和抗肿瘤能力也具有促进作用，从而提高抗肿瘤效果[23]。另外，色氨酸和胸腺嘧啶通过减少细胞增殖和激活TLRs，不仅可以抑制尿路上皮癌变还可增强BCG对于NMIBC患者的疗效[24]。

虽然BCG能诱导T细胞募集到膀胱，但T细胞表型并没有明显改变。研究发现，在BCG治疗后CD4+T细胞、CD8+T细胞或FoxP3+Treg的表达在应答者和非应答者之间无明显差异[25]，证实了这一观点。因此提示我们可以将T细胞激动剂与BCG联合应用，来增强T细胞活化并改变肿瘤组织内T细胞表型，从而提高BCG在NMIBC治疗的临床疗效。另有研究证明，4-1BB(CD137,TNFRSF9)是在T细胞上表达的一种共刺激分子，不仅可使淋巴细胞上抗凋亡分子的增殖增加，还可促进BCG与TLR激动剂结合，在NMIBC患者中提高抗肿瘤效果[26]。

目前有多种免疫治疗与靶向药物联合应用方案，研究较多的则是免疫检查点抑制剂。研究发现，在BCG无应答的NMIBC患者中，PD-L1+患者CD4+T细胞数量较少，相反PD-L1-患者CD4+T细胞数量较多，而CD8+T细胞在两者中无明显差异。因此PD-L1免疫检查点抑制剂可能会改善NMIBC治疗效果[27]。在VANDEVEER等[28]在研究中也证实了上述观点，通过联合PD-L1抑制剂Avelumab和BCG治疗NMIBC小鼠发现，肿瘤内CD4+和CD8+细胞数量增加，治疗效果显著提高。另外，BCG治疗过程中募集的Tregs细胞占较大比例，虽然高比例的Tregs细胞与BCG治疗后的快速复发相关，但这对BCG与PD-1/PD-L1检查点抑制剂的联合使用疗效具有一定的增强作用，对NMIBC患者来说也是一种较有潜力的治疗方向[29-30]。最近发现一种IL-15超激动剂，具有强大激活NK细胞和T细胞的能力，表现出较强的抗肿瘤活性。IL-15激动剂ALT-803与BCG联合治疗后，抗肿瘤能力明显增加，肿瘤负荷减少46%[单独使用BCG为15%，单独使用Altor BioScience Corporation-803(ALT-803)为15%],而这与诱导NK细胞增殖和活化的IL-1α、IL-1β和CCL5的生成和分泌增加有关。

4 预测BCG及联合免疫治疗疗效与预后

BCG膀胱内免疫治疗已被广泛应用于NMIBC的治疗，但治疗后膀胱肿瘤复发率仍高达40%。因此，通过预测因子对有可能复发或进展的NMIBC患者进行预测，有助于临床医生制定治疗策略和随访计划。传统的临床因素已被临床用于预测NMIBC患者的预后结果，例如肿瘤分期、分级、数量和组织病理学特征。之前普遍认为BCG疗效的预测因子主要集中在肿瘤标志物上，但现在广大学者认为预测因子主要是NMIBC患者产生免疫反应的能力，故免疫细胞种类或比例、细胞因子等对于预测BCG治疗NMIBC患者预后是近些年的研究热点。

一项前瞻性研究发现人趋化因子配体27(human chemokine ligand 27,CCL27)是预测BCG疗效的首选生物标记物，可促进Tregs向肿瘤微环境(tumor environment,TME)募集，并且血清CCL27水平升高与NMIBC TME中Tregs密度呈正相关，从而提高了BCG治疗后的DFS[31]。另外，在膀胱、膀胱肿瘤及不同阶段膀胱肿瘤中，E2F4基因表达(E2F转录家族成员，一种癌基因)评分有显著差异。研究发现，E2F4评分可用于预测NMIBC的进展、复发和患者对BCG膀胱灌注治疗的反应性或敏感性[32]。

在一项对于T细胞反应的功能测试中发现，50%复发患者经结核菌素诱导后分泌的IL2低于120 pg/mL，而无复发患者均高于此值，表明体外结核菌素刺激分泌的IL2作为BCG免疫治疗成功的预测因子来说具有很大的潜力[33]。另研究发现，T细胞与单核细胞样-髓源抑制性细胞(monocytic-myeloid-derived suppressor cells,M-MDSCs)之比(已知可抑制抗肿瘤免疫)与无复发生存结局密切相关，对预后也有一定的潜在价值[27]。

单个细胞因子的变化与NMIBC复发有一定关系，但主流观点认为多细胞因子组合是最佳预测方式。一项对于BCG治疗后尿细胞因子变化的临床实验发现，根据尿中9种可诱导细胞因子(IL-2、IL-8、IL-6、IL-1ra、IL-10、IL-12[p70]、IL-12[p40]、TRAIL和TNF-α)含量构建的列线图(CyPRIT)可预测NMIBC复发的风险，从而指导临床BCG治疗剂量和持续时间[34]。但该实验涵盖患者数量较少，具有一定的局限性，有待进一步外部验证。另外，NMIBC患者经BCG治疗后，PD-L1表达水平显著提高，故其可能在对于BCG无反应患者的潜在选择上具有重要作用，以便于早期识别NMIBC患者是否能从BCG治疗中获益。而现研究发现复发肿瘤周围的免疫细胞肉芽肿中PD-L1高水平表达，且肉芽肿中PD-L1的累积可降低机体对BCG的免疫应答[35]。因此PD-L1抗体和BCG联合治疗对于BCG无反应患者来说可能是一种新的治疗方向。

5 问题与展望

综上所述，BCG膀胱灌注治疗可有效降低NMIBC患者的复发率、进展率及死亡率，但由于其较为明显的副作用、高昂的治疗成本及疗效受多种因素的影响等，一定程度上限制了BCG在临床的应用。随着科技水平及科研技术的进步，BCG治疗NMIBC机制的不断探索，涌现出很多新的治疗方式，例如BCG联合免疫治疗(免疫检查点抑制剂、细胞因子、肿瘤疫苗等)及BCG序贯治疗时间、用量和给药途径的改变等。通过利用预测因子对有可能复发或进展的NMIBC患者进行预测，从而有助于临床医生制定治疗策略和随访计划。尽管上述方法提供了NMIBC治疗的新思路，且显现较好的应用前景，但还缺乏大量的临床数据验证，需后续高质量研究进一步推动BCG治疗NMIBC的迅速发展。