氧化应激在动脉粥样硬化发病中的作用研究进展

侯雅新，林 飞，李奕帛，关 硕，孟卫正，赵国安

(1．新乡医学院第一附属医院心脏中心，河南 卫辉 453100;2．河南省心血管损伤与修复国际联合实验室，河南 卫辉 453100；3.河南省心脏线粒体生物医学工程研究中心，河南 卫辉 453100)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)在世界范围内占疾病总死亡率的30%左右，是心血管疾病患者最重要的死亡原因[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是CAHD的主要病理机制。内皮功能障碍、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖迁移和泡沫巨噬细胞形成所引起的脂纹、粥样斑块以及纤维斑块是AS形成与发展的首要因素[2]。氧化应激(oxidative stress，OS)主要由活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)增多引起，OS可使高活性反应分子的产生和抗氧化作用之间长期失衡导致血管内皮重塑、组织损伤，最终发生AS[3]。大量研究显示，在内皮细胞(endothelial cell，EC)、VSMC和巨噬细胞中，线粒体功能紊乱和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)可引起体内ROS生成过多，并通过多种途径造成EC功能受损、VSMC增殖迁移、巨噬细胞泡沫化和炎症反应，从而加速AS的发展[4]。本文旨在从EC、VSMC以及巨噬细胞3个方面论述OS对AS的影响，为冠状动脉粥样硬化的临床治疗提供参考。

1 OS的产生

生理情况下，机体氧化与抗氧化作用处于动态平衡，体内各种内源性抗氧化酶可清除ROS[5]，维持细胞氧化还原自稳态。ROS主要包括超氧阴离子(superoxide anion，O2-)、羟自由基(hydroxyl radical，OH-)和过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)，同时OS相关酶如NOX、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)、血红素氧合酶-1、髓过氧化物酶等参与ROS的形成。在心血管系统中，ROS主要由线粒体非偶联呼吸和NOXs产生[6]。NOXs家族成员中NOX1、NOX2、NOX4和NOX5在心血管系统的细胞中表达，NOX2和NOX4存在于内皮细胞中，NOX1和NOX5主要在VSMC表达，而巨噬细胞可能表达NOX1、NOX5，这些酶共同促成ROS的形成[7]。此外，转录活化因子、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、碱性成纤维细胞生长因子、血小板生长因子、缺氧复氧及缺血再灌注损伤等因素可以激活OS反应，调控EC功能、VSMC的增殖迁移、缺血再灌注损伤以及炎症反应，促进AS的形成与发展[8]。

2 OS与AS

2.1 OS调控血管内皮细胞功能促进AS的发展EC结构和功能受损是AS早期发生与发展的关键环节，受各种刺激因素如机械、血压、血脂和吸烟等的影响。氧化损伤是EC结构和功能障碍的主要原因，EC可因线粒体呼吸作用和NOXs生成增加使ROS产生过多，激发OS反应，引起EC黏附或激活相关通路，造成EC结构和功能受损。

2.1.1 线粒体呼吸作用和NOX介导内皮细胞生成ROS的机制线粒体膜去极化使复合物Ⅰ、Ⅲ的活性增加从而促进ROS的产生，而线粒体膜的超极化会导致ROS的过量产生[9]。辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是线粒体呼吸链的组成部分之一，具有减轻氧化应激损伤、改善线粒体功能、促进能量代谢等功能[10]。有研究报道，CoQ10可以通过抑制ROS的过度释放，增加腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量，从而改善线粒体功能，预防AS[11]。线粒体功能障碍介导的ROS生成增加可引起线粒体DNA功能失调，使氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)在血管壁沉积，导致AS发生[12]。

NOX是一种具有跨膜亚基的跨膜蛋白，是线粒体电子传递链重要组成部分和细胞产生ROS的重要来源。JING等[13]研究发现，对甲酚硫酸盐可上调EC和单核细胞中NOX4表达，促进ROS产生。在糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠的体内中发现，NOX2可促进ROS水平增加，且NOX抑制肽NOX2ds-ta在抑制NOX2活性后可降低胰岛素抵抗的EC中OS水平，促进一氧化氮(nitric oxide，NO)产生，使受损血管的舒张功能恢复并抑制AS的发展[14]。晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)在EC中可降低线粒体膜电位、ATP含量及过氧化氢酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，从而增强NOX活性，诱导ROS产生，促进OS； 另外，AGEs可作用于晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)而激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，诱导ROS产生和线粒体功能障碍[15-16]。

2.1.2 ROS介导EC损伤导致AS发生、发展的机制大量ROS作用于EC基底膜时可损伤机体抗氧化系统，降低SOD、CAT、谷胱甘肽硫转移酶等抗氧化酶活性，导致EC基底膜中的脂质氧化，引起EC屏障功能受损[17]，进而引起血小板黏附、聚集，释放出血小板源性生长因子、转化生长因子等炎症介质，导致血管发生AS。EC屏障功能损伤引起EC中ICAM-1和VCAM-1显著上调，进而增强单核细胞对EC的黏附，并激活p38/磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/苏氨酸激酶(serine threonine kinase,Akt)通路，产生ROS和激活IκB合酶(IκB kinase，IKK)，促进AS的发展[18]。血管EC间缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)介导的ROS传递导致酪氨酸激酶2(janus kinase 2，JAK2)/转录因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路失活，引起下游基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)-2和MMP-9表达减少[19]，降低黏附分子表达和单核-内皮细胞黏附导致AS发生。有研究报道，在AS斑块中ROS可以激活酪氨酸激酶，使血管EC间钙黏蛋白等细胞连接分子磷酸化，促进血管内皮屏障功能受损，造成大量红细胞和白细胞溢出、斑块内出血及斑块破裂，使AS斑块恶化导致心肌梗死[20]。

ROS通过多种通路发挥OS作用。研究显示，刺激AMPK/沉默信息调节因子1(silent information regulator，SIRT1)信号通路可增加细胞内炎症反应，使细胞内ROS水平明显升高、线粒体膜电位水平显著降低，导致胆固醇结晶诱导的内皮细胞焦亡，促进AS斑块的发展[21]。ROS可通过干扰NO信号通路，介导内皮功能障碍和血管异常，导致eNOS解偶联。当eNOS解偶联时，使NO转变为O2-和过氧亚硝基阴离子，引起NO总量减少、生物利用度降低，导致血管舒张受限，促进AS发展[22]。精氨酸酶上调可使eNOS解偶联，导致内皮功能障碍和血管僵硬。有研究报道，在高糖条件下，L-瓜氨酸和L-精氨酸均能降低ROS的产生和p67phox的表达，促进eNOS解偶联而转化为NO，具有延缓EC衰老及抗AS作用[23]。DUBOIS-DERUY等[24]研究报道，血管紧张素II(angiotensin II，AngII)和NO之间的失衡可以抑制eNOS，加速apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化；N-硝基-L-精氨酸甲酯激活肾素-血管紧张素系统可使ROS和诱导性NOS上调，促进AS发展。MAEDA等[25]研究报道，利伐沙班可以激活eNOS，抑制p22phox，增加血浆NOX水平，降低O2-，抑制EC衰老，恢复EC功能，防止AS的发展。

2.2 OS通过调控VSMC增殖、迁移促进AS发生、发展VSMC是组成血管壁的一种多潜能细胞，在维持血管壁的结构、张力及血管重塑中发挥重要作用。在OS环境下，VSMC中的线粒体呼吸作用减弱引起过量ROS的产生，促使VSMC增殖、迁移以及细胞外基质的大量蓄积，加速AS的发展及血管重塑。

2.2.1 线粒体呼吸作用和NOXs诱导VSMC中ROS的产生线粒体呼吸作用减弱使ATP生成减少，促进AKT磷酸化、抑制基质金属蛋白酶-9活化，进而促进ROS产生[26]。肥胖、高血脂、高血压、吸烟、糖尿病、衰老等多种因素均会引起线粒体中ROS产生增加，进而损伤线粒体DNA；同时线粒体DNA损伤又可以削弱VSMC呼吸复合体的表达和线粒体呼吸，导致线粒体ROS水平增加并使ATP产生减少[27]，形成恶性循环，促进AS的形成及发展[28]。

线粒体中NOXs可通过转运电子跨膜，消耗O2发生催化反应，所生成的O2-和H2O2是ROS合成的重要成分[8]。研究指出，AngⅡ可诱导NOX1刺激线粒体ROS产生，导致线粒体功能障碍和血管衰老[29]，且线粒体ROS可诱导吞噬细胞和心血管组织中NOX1的激活，进而促进AS[30]。聚合酶d-相互作用蛋白2(polymerase d-interacting protein 2，Poldip2)是协助NOX4参与OS的重要蛋白，Poldip2缺乏会诱导代谢重编程，抑制线粒体呼吸并增加糖酵解活性，促进VSMC表型调节[31]，但Poldip2增多同时可使NOX4活性增强而刺激ROS的产生，促进VSMC增殖迁移及新生内膜的形成[32]。

2.2.2 ROS诱导VSMC迁移和增殖促进AS发生、发展的机制ROS是保持细胞氧化稳态和细胞信号通路的重要调节因子，在多种通路中均发挥关键作用。有研究报道，高糖可增加AGEs、ICAM-1和黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)等炎症因子的表达及ROS的增加，促进VSMC增殖、黏附和迁移；激活ROS后可触发p38信号诱导NF-κB，增加白细胞介素(interleukin,IL)-6产生而促进VSMC发生分化、迁移和增殖，导致脂质蓄积而促进AS的发生、发展[15]。研究发现，AGEs通过刺激NOXs产生ROS在VSMC凋亡和钙沉积中发挥重要作用[33]。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor-E2-related actor 2/heme oxygenase，Nrf2/HO-1)信号轴是OS调节的重要信号轴之一，具有抗炎、抗氧化、减少线粒体损伤等作用。在体外诱导高糖情况下，上调microRNA-24可通过激活Nrf2/Ho-1信号抑制细胞内反应性ROS的产生及丙二醛和NOX的活性，从而抑制OS反应[34]，促进糖尿病大鼠的血管重塑。

2.2.3 血红素氧合酶-1和髓过氧化物酶参与VSMC增殖氧化应激催化酶除NOXs和NOS参与ROS产生外，还有血红素氧合酶-1、髓过氧化物酶，其也参与ROS的产生。研究指出，HO-1可以通过降解血红素产生的一氧化碳抑制VSMC从动脉中层向内膜的迁移和增殖[35]。另有学者研究报道，抑制Krüppel样因子10表达可上调HO-1，使ROS产生减少，进而对高糖暴露的VSMC产生抗氧化作用。髓过氧化物酶作为体内ROS产生的主要催化酶之一，可催化底物H2O2生成次氯酸，进而释放ROS，从而损伤血管壁，诱导炎症介质产生，促进VSMC增殖，使管腔发生狭窄引起CAHD[36]。

2.3 OS通过调控巨噬细胞免疫炎症参与AS发生、发展巨噬细胞是一种多功能的免疫细胞，在AS的形成和发展中发挥重要作用。ox-LDL、炎症因子、NOXs等因素刺激引起的一系列OS反应可使ROS生成过多，导致巨噬细胞源性泡沫细胞的形成和凋亡以及免疫炎症反应，致使AS形成。

2.3.1 巨噬细胞中NOXs诱导ROS产生的机制NOX1和NOX5在巨噬细胞中发挥显著的致AS作用。BARTON等[37]研究报道，糖尿病ApoE-/-小鼠敲除NOX1具有显著的抗AS作用，这一作用与ROS生成减少、趋化因子表达减弱、白细胞黏附和巨噬细胞浸润减少以及促炎和促纤维化标志物表达降低有关。MANEA等[38]研究发现，NOX5调节Ca2+水平使血管发生OS，当巨噬细胞暴露于较高浓度的γ-干扰素或ox-LDL时，NOX5蛋白表达会呈剂量依赖性增加，细胞内Ca2+浓度也会升高；而应用小干扰RNA沉默NOX5蛋白表达后，Ca2+依赖的NOX活性下降，促使选择性Ca2+载体A23187诱导的巨噬细胞中ROS形成减少，从而减轻AS严重程度。

2.3.2 ROS诱导泡沫巨噬细胞的形成和凋亡参与AS的发生、发展ROS增加能够促进ox-LDL引起的泡沫细胞形成，从而加重炎症反应、巨噬细胞凋亡、易损斑块破裂和继发血栓的形成[39]。研究表明，ox-LDL能促进ROS的生成增多，降低 SOD的活性及IL-37水平，使胆固醇在巨噬细胞内聚集，产生泡沫细胞，加速AS[40]。同时，ox-LDL可上调氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)基因调节钙蛋白酶，引起巨噬细胞迁移和泡沫细胞形成。重组人硫氧还蛋白通过抑制ROS的产生，激活p38 丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和血凝素样LOX-1表达，从而抑制ox-LDL刺激的泡沫细胞形成和巨噬细胞凋亡[41]，因此，这一通路可能成为治疗AS的潜在机制。体外研究发现，ox-LDL刺激巨噬细胞后产生的ROS可以激活NLRP3炎症小体引起 AS，硫氧还蛋白还原酶-1可以减少ROS进而抑制NLRP3炎症小体的作用，发挥抗AS作用[42]。巨噬细胞受体CD36结合ox-LDL后可介导血管生成、单核细胞分化、巨噬细胞中脂质积累、脂肪酸转运和细胞凋亡的负调控，促进AS的发生[9]。Szeto-Schiller 31(SS-31)可特异性靶向清除线粒体内膜的ROS。通过细胞内油红O染色和胆固醇含量的测定证明，SS-31可能通过清除ROS和抑制胆固醇流入而对泡沫细胞形成中的巨噬细胞产生有益作用[43]。

3 结语与展望

生理情况下，适当的OS使得机体氧化与过氧化保持平衡，对机体具有保护作用；而线粒体功能紊乱和NOXs生成过多等因素可促使ROS生成过多及抗氧化酶活性降低，细胞内DNA、RNA、蛋白质以及脂质等将受到过氧化损伤，引起不同细胞功能异常，促使内皮功能障碍、VSMC迁移和增殖以及巨噬细胞免疫炎症等病理反应，导致AS的发生、发展。目前临床中常用的维生素、叶酸可改善内皮功能发挥抗氧化作用；多酚类药物可增加eNOS的表达和激活发挥抗炎和抗氧化作用。同时，通过线粒体靶向疗法改善线粒体功能、抑制ROS的大量产生、减轻OS有望成为临床治疗AS的重要靶点，并可显著降低AS患者的发病率及不良心血管事件，改善CAHD患者的预后。