经血源子宫内膜干细胞分离培养及制备标准操作规程

2021-11-30河南省细胞生物学会干细胞专业委员会

新乡医学院学报 2021年11期

河南省细胞生物学会干细胞专业委员会

中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会

目前，干细胞技术已成为很多难治性疾病治疗的新希望。通过干细胞移植、分化与组织再生，促进机体创伤修复、疾病恢复，给疾病的临床治疗带来了颠覆性变化[1-3]。在与新型冠状病毒肺炎疫情的抗争中，干细胞技术成为治疗新型冠状病毒肺炎的一种具有良好临床前景的选择，而干细胞技术的安全性、有效性得到了临床与科研数据的验证，为战胜疫情提供了强有力的科技支撑[4-7]。截至目前，国内通过国家卫生健康委员会备案的干细胞研究机构已超过100家，国家也正在大力支持干细胞的临床转化，已批准干细胞技术在数十种疾病的治疗上进行临床研究[8]。近年来，国家频发政策支持干细胞行业的发展，干细胞的监管模式逐渐明朗，《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》的颁布，意味着我国干细胞治疗产品的上市审批道路逐渐打通，患者使用干细胞产品治疗的时代即将到来[9]。2021年2月9日，国家卫生健康委员会在官网发布的《对十三届全国人大三次会议第4371号建议的答复》中，明确表示支持推动示范区干细胞治疗、细胞免疫治疗等医疗技术的临床应用，答复函中明确提出：“国家卫生健康委员会一直鼓励和支持干细胞研究、转化和产业发展。”干细胞制剂具有明显的药品属性，国家药品监管部门审批后可以应用，既有利于保障医疗质量安全，又有利于产业化、高质量发展[10]。

经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood derived endometrial stem cells,MenSCs)凭借其丰富的来源、采集和分离方式的无侵入性、良好的增殖活性等优势获得国内外广泛关注[11-13]。在临床应用MenSCs的安全性获得保障的前提下，其已在骨损伤、心肌损伤、肝脏损伤、子宫内膜损伤及中风等疾病的治疗过程中展示了良好的治疗效果[14-19]。截至2020年6月，国家卫生健康委员会已备案干细胞相关治疗项目74个，其中包括6项与MenSCs相关的临床备案项目。上述临床研究项目的备案与开展不仅表明MenSCs有巨大的应用前景与市场，也说明建立子宫内膜干细胞相关质量标准的紧迫性和必要性。目前，尽管已经出台多项间充质干细胞分离培养及制备的地方或行业标准[20-25]，但针对MenSCs规范化、标准化的细胞分离培养及制备操作规程尚未见报道。因此，基于上述MenSCs的技术开发与应用中所存在的机遇与挑战，本项目以新乡医学院干细胞与生物治疗技术研究中心、河南省干细胞工程实验室、河南省干细胞与生物治疗工程研究中心等科研平台为基础，参考现有间充质干细胞分离培养及制备的方法，通过校企合作的方式与新乡高新区中源干细研究院和北京臻溪谷医学研究中心共同建立形成了符合药品生产质量管理规范(goods mamufacturing practice,GMP)的、标准的、规范化的MenSCs分离培养及冻存等操作流程，以期为各科研生产单位在制备MenSCs制品的过程中提供借鉴，促进MenSCs的建库工作，为MenSCs的临床推广应用提供技术保障。

1 本操作规范的目的和适用范围

1.1 目的规范MenSCs的分离、培养、入库过程，充分利用每一份经血样本，有效提高样本中MenSCs原代细胞的分离数量。

1.2 适用范围本规范适用于MenSCs的原代分离培养、传代培养及冻存等规范化操作流程。

2 操作人员职责

2.1 制备操作进行制备前的准备、整个制备过程的操作及制备后的清场、记录填写和样品送检、培养过程中的细胞观察等。

2.2 质量控制接收送检样品，进行样品检测并出具检测报告。

2.3 现场质量保证确保制备操作前制备环境正常，使用设备处于正常运行状态，制备人员整个操作过程符合标准操作规程，记录填写及时、正确，取样点正确，样品送检及时。

3 物料需求

3.1 耗材器械盒、100 mm培养皿、50 mL离心管、T75培养瓶、T175培养瓶、10 mL移液管、25 mL移液管、1.5 mL离心管、5 mL 离心管、2 mm孔径滤网、100 μm细胞滤网、50 mL注射器，2 mL冻存管。

3.2 试剂基础培养基、血清替代物、生理盐水、体积分数75%医用乙醇、1.25 g·L-1胰蛋白酶、消化终止液、细胞冻存液。

4 细胞培养代次定义

原代细胞：样本接种后培养至融合度为70%～80%的细胞为原代细胞。

第1代细胞(passage 1,P1)：原代细胞按照本规程操作消化接种后，培养至融合度为85%～90%，可以收获或传代的细胞为第1代细胞。

第2代细胞(passage 2,P2)：第1代细胞按照本规程操作消化接种后，培养至融合度为85%～90%，可以收获或传代的细胞为第2代细胞。

本规程中所述的种子细胞特指第2代细胞。

5 工作规程

5.1 环境要求(1)MenSCs种子细胞的分离、培养和冻存操作在C级洁净室中进行，开放式操作必须在A级环境内进行(生物安全柜)；(2)制备人员(固定的岗位名称，与质量管理手册一致)应提前对细胞操作间和生物安全柜进行紫外线灭菌，紫外线照射时间为30 min。

5.2 操作前准备(1)开启C级洁净室中各生物安全柜相关操作单元紫外线灯照射30 min，关闭各操作单元紫外线灯后通新风10 min，保持各操作单元处于运行状态；(2)从准备间4 ℃冰箱或采集套装中取出装有经血的样本采集管，使用喷有体积分数75%乙醇的无尘布将经血样本采集管自管口向管底螺旋式擦拭一遍后再放入传递窗，C级洁净室中的制备人员从传递窗中取出经血样本采集管，再使用喷有体积分数75%乙醇的无尘布擦拭一遍，然后将其放入处于运行状态的生物安全柜中。(3)从C级洁净室的洁净物料间取出所需耗材置于物料推车上，再将物料推车推至生物安全柜旁边。(4)从洁净物料间4 ℃冰箱中取出培养基，正立放置于37.0 ℃恒温金属浴，使其恢复至37 ℃。(5)取出生理盐水瓶，使用喷有体积分数75%乙醇的无尘布将生理盐水瓶自瓶口向瓶底螺旋式擦拭一遍，去除瓶口塑料盖后将其放入生物安全柜中。(6)开启玻璃瓶装生理盐水瓶塞：先用止血钳夹断瓶口铝外套，再用镊子夹取体积分数75%乙醇棉球，将棉球一侧固定在橡胶瓶塞与玻璃瓶口接合处，环绕一周进行擦拭，再用棉球另一侧擦拭瓶塞顶端；弃去乙醇棉球，静置，待瓶口乙醇挥发后倾斜生理盐水瓶，使其与台面呈45°，然后应用止血钳夹紧橡胶塞边缘一角(止血钳勿接触玻璃瓶口)，施力拔下瓶塞。

5.3 细胞原代培养(1)在制备档案上记录环境状况和经血样本信息。(2)使用体积分数75%乙醇擦拭采集管外壁。(3)吸取7 mL样本密度分离液加入15 mL离心管中，然后沿管壁缓慢加入7 mL经血样本(含收集液)，置于水平转子离心机中，4 ℃、1 800 r·min-1离心25 min。(4)离心完毕后取中间白膜层转入新的50 mL离心管中，加入生理盐水重悬，所抽取白膜层与生理盐水体积比例为1：2；1 500 r·min-1离心5 min，洗涤2次，将末次离心后的上清液留样进行支原体、细菌及真菌检测。(5)将白膜层离心后的沉淀加入MenSCs原代完全培养基，吹打均匀，均匀接种至T75培养瓶中，每瓶12 mL(在15 mL离心管中，不超过0.5 mL沉淀时接种1个T75培养瓶，超过0.5 mL沉淀时接种2个T75培养瓶)，随后将细胞培养瓶水平置于37 ℃、含体积分数5% CO2的恒温培养箱中培养48 h。(6)将“5.3(3)”项中密度梯度离心完毕后所获得的最下层细胞沉淀加入10 mL红细胞裂解液，室温裂解5 min，1 200 r·min-1离心5 min，如未裂解完全，可重复上述步骤；离心后的沉淀加入10 mL生理盐水吹打，1 200 r·min-1离心5 min，洗涤2次；将末次离心后的上清液留样进行支原体、细菌及真菌检测。(7)将离心后的沉淀加入MenSCs原代完全培养基，吹打均匀，均匀接种至T75培养瓶中，每瓶12 mL(在15 mL离心管中不超过0.5 mL沉淀，接种1个T75培养瓶；超过0.5 mL沉淀，接种2个T75培养瓶)，随后将细胞培养瓶水平置于37 ℃、含体积分数5% CO2的恒温培养箱中培养48 h。(8)全量换液：培养48 h后进行一次全量换液，吸去旧培养液，10 mL 生理盐水冲洗2～3次，除去未贴壁组织及细胞；添加新鲜MenSCs原代完全培养基，T75瓶每瓶12 mL，置入37 ℃、含体积分数5% CO2的恒温培养箱中继续培养，每3 d观察、换液1次。

5.4 原代收集(1)培养至第5～7天，在倒置显微镜下观察细胞形态有无异常及细胞有无污染。待细胞融合度达到80%～90%时即可进行消化收获。若细胞融合度未达到40%～50%，将培养瓶中细胞分别按下述步骤进行消化和终止，1 200 r·min-1离心5 min。离心完毕后加入2 mL新鲜MenSCs原代完全培养基重悬细胞沉淀，待细胞吹打均匀后将2 mL 细胞悬液加入含有10 mL培养基的T75培养瓶中，T75培养瓶中的细胞及培养基的最终体积为12 mL；注意：原代细胞培养时间不得超过14 d。(2)生理盐水轻轻冲洗细胞培养瓶底2次，每次每瓶10 mL。(3)消化：将1.25 g·L-1胰蛋白酶加入洗涤后的T75培养瓶中，每瓶1 mL，轻摇叠加培养瓶，使每个培养瓶的消化液均能浸润培养瓶底面。在培养箱中静置3～5 min后取出培养瓶，左右轻轻晃匀，并于倒置显微镜下观察，待见镜下细胞变圆、大部分细胞脱落即表示消化可终止；(4)终止消化：向可终止消化的培养瓶中加入消化终止液，每瓶5 mL，终止消化，再将终止消化后培养瓶中细胞悬液转移至50 mL的离心管中，然后用10 mL的生理盐水洗涤黏附在培养瓶中的残余细胞，并将洗涤后的细胞悬液一并转移至50 mL离心管中(加入胰蛋白酶到终止消化，时间不超过10 min)。(5)离心洗涤：将离心管配平后置入离心机，1 200 r·min-1离心5 min。(6)合并离心后的细胞沉淀：离心后将洗涤上清液弃去，加入5～10 mL生理盐水重悬细胞，最终将重悬后的细胞悬液合并到1个50 mL离心管中，并定容至40～45 mL。(7)取样计数、计算细胞活率：将定容后的细胞悬液吹打混匀，先取不超过0.5 mL 的细胞悬液转移到1.5 mL 离心管中，使用细胞计数仪进行收获细胞总数和细胞活率的计算。注意：如果1个50 mL离心管可以完成操作，则在步骤“5.4(5)”前取样计数，不必离心第2次。

5.5 细胞传代(1)计算传代数量：根据计数结果，并按照每个T175瓶2×106个细胞传代密度，计算传代需要的T175培养瓶数量。(2)去上清液、重悬细胞悬液：1 200 r·min-1离心5 min后将上清液去除，应用适量培养基重悬离心后的细胞沉淀(按每瓶接种2 mL细胞悬液计算)。(3)根据最终传代T175培养瓶数量及生物安全柜一次能放置T175培养瓶的容量(不超过25瓶)，将所需T175培养瓶排成一排，竖直摆放在生物安全柜内，在瓶壁上标注细胞编码、细胞代数、培养时间等信息后，开盖，用25 mL移液管加入培养基，每瓶23 mL。(4)接种：将细胞吹打均匀后分别往已加23 mL培养基的T175培养瓶中每瓶加入2 mL细胞悬液(1×109L-1)，使每个T175培养瓶中的细胞及培养基的最终体积为25 mL。(5)混匀：加完细胞悬液后将T175培养瓶瓶盖拧紧，以3个叠加后将培养瓶平置，轻轻混匀10 s，使加入细胞悬液均匀分布于整个培养瓶底面。(6)放入CO2培养箱培养：将接种后的T175培养瓶以3个叠加平稳置于37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养至细胞融合度达到85%～90%。

5.6 传代细胞收集(1)弃去培养瓶中的旧培养基，使用生理盐水轻轻冲洗细胞培养瓶2遍。(2)消化：于洗涤后的培养瓶中加入1.25 g·L-1胰蛋白酶，每瓶2 mL，轻摇叠加培养瓶，使每个培养瓶的消化液均能浸润培养瓶底面。在培养箱中静置1 min后取出培养瓶，轻轻拍打，取1个培养瓶于倒置显微镜下观察，镜下见细胞变圆、大部分细胞脱落即表示消化可终止(加入胰蛋白酶到终止消化，时间不超过5 min)。按步骤“5.4(2)至5.4(4)”进行消化和终止，消化后的细胞悬液移至1个50 mL离心管中，洗瓶1～2次，洗瓶后的液体也移至同1个50 mL离心管中。(3)离心洗涤：将离心管配平后放入离心机，1 200 r·min-1离心5 min。(4)合并离心后的细胞沉淀：离心后将洗涤上清液弃去，用10 mL的生理盐水重悬细胞，将重悬后的细胞悬液合并到1个50 mL 离心管中，并定容至40 mL。(5)取样计数、计算细胞活率：将定容后的细胞悬液吹打混匀，取不超过0.5 mL的细胞悬液转移到1.5 mL 离心管中，进行收获细胞总数和细胞活率的计算，并进行支原体、细菌及真菌检测。

5.7 细胞冻存(1)从4 ℃冰箱中取出冻存液，根据步骤“5.6(5)”细胞计数结果，离心获得细胞沉淀，在离心管中加入适量的冻存液，重悬细胞沉淀，用1 mL枪头轻轻吹打均匀，使细胞密度与要求冻存密度一致(5.0×109～1.0×1010L-1)。(2)根据冻存规格，将细胞悬液按每支冻存管1 mL的标准分装于2 mL的冻存管中。(3)贴标签，封口：将分装后的冻存管贴上冻存细胞编码标签，封口膜封口。

5.8 使用程序降温盒或程控降温仪冻存细胞(1)使用程序降温盒冻存细胞：把含细胞的冻存管放入4 ℃ 冰箱中预冷10 min；把含细胞的冻存管放入4 ℃ 预冷的程序降温盒中，并转移到-80 ℃超低温冰箱中；12～16 h内利用中转罐转移到临时储存罐中，暂存。(2)利用程控降温仪冻存细胞：检查程控降温仪、杜瓦罐及电脑和打印机是否连接完好；打开电脑和程控降温仪；打开液氮阀门，点击“CRF”图标运行程控降温仪软件；点击“Run”按钮，输入使用用户名和密码；如果一切正常，软件会自动弹出一个对话框选择冷冻规程，然后选择脂肪冻存规程；把含细胞的冻存管放入程控降温仪的腔体内；把探针插入标准样的冷冻管中，关闭程控降温仪的门；点击“Start”按钮；等待腔体温度降到4 ℃，5 min后进入下一步，然后程控降温仪将自动运行直至结束：首先，以2 ℃·min-1的降温速率运行，直至样本温度达到-40.0 ℃；随后，以10 ℃·min-1的降温速率运行，直至样本温度达到-80.0 ℃；打印并保留冻存曲线图；关闭电脑和程控降温仪，关闭液氮阀门；操作结束后，将冻存管用中转罐转移到临时储存罐中暂存。

5.9 在制备档案上及时记录相关信息详细记录从经血样本接收到干细胞入库全过程，包括人(操作人员、操作时间)、机(所使用的仪器名称、编号)、料(所使用的物料、物料批号)、法(制备工艺流程、参数)、环(制备房间、温湿度)、测(检测项目、检测结果)等方面，并形成完整实验记录(生产、检测)。

6 展望

前期大量基础及临床研究结果已证实，MenSCs移植在多种难治性疾病的治疗中取得了改善良好效果，且样本采集、分离获得MenSCs具有无创伤性，同一供体可周期性多次采集获得MenSCs，从而获得大量遗传背景一致的种子细胞，并且MenSCs具有自体移植的优势，使其成为干细胞治疗中非常具有潜力的种子细胞。因此，建立符合GMP生产要求、标准化、规范化的MenSCs细胞生产制备标准操作流程，是保证MenSCs细胞制品质量的前提，其不仅为MenSCs临床治疗效果提供保障，也进一步为深入探索其对相关疾病的改善机制奠定坚实基础。因此，本文在参考已有间充质干细胞标准操作的基础上，结合MenSCs自身的特性，通过长期的摸索及实践，已完成针对MenSCs种子细胞分离培养及制备标准操作流程，后续将根据研究的深入及相关技术的发展，与时俱进地对现有MenSCs标准操作进行升级和补充。相信基于本文所建立的MenSCs种子细胞分离培养及制备标准操作，可为各科研及生产单位在制备MenSCs细胞制品的过程中提供借鉴，促进MenSCs干细胞资源库的建立，为MenSCs的临床使用，包括细胞移植数量、细胞移植时间窗及细胞移植途径等关键参数的优化提供支持与保障，从而推动MenSCs临床应用进程。