MCM蛋白在消化系统肿瘤的研究进展

商昌权 李国东 魏九峰 综述 刘明 校审

微小染色体维持(Minichromosome maintenance，MCM)蛋白是由MCM基因编码，由六个相关蛋白组成(MCM2～MCM7)的蛋白家族。MCM蛋白家族各成员的分子质量大小不一，多由776～1 017个氨基酸残基构成。MCM蛋白家族成员间有很高的序列相似性，在DNA的复制过程中，MCM蛋白使一个细胞周期中DNA复制仅出现一次[1]。MCM蛋白与肿瘤密切相关[2]，MCM蛋白有成为新的肿瘤标记物的可能性，靶向MCM蛋白可能会成为新的治疗策略[3]。

1 MCM蛋白

1.1 MCM蛋白的结构

MCM蛋白主要由ATP酶AAA+亚类结构组成。最早发现包括MCM2、MCM3、MCM4(CDC21)、MCM5(CDC46)、MCM6(MIS5)、MCM7(CDC47)，各个蛋白都具有特征性的ATPase结构域，它们六个的保守亚基相连构成异六聚体结构，是真核DNA复制所必需的。随着深入研究还发现了MCM8、MCM9、MCM1和MCM10。MCM蛋白家族成员有高度的同源性，都拥有一个约200多个氨基酸长度的区域，被称为MCM盒(MCM1和MCM10不拥有)[4]。MCM1和MCM10尽管被纳入MCM蛋白家族，且也参与DNA的复制，但它们与MCM2-7蛋白并不存在同源性[5]。MCM盒包括Walker-A模序、Walker-B模序及丙氨酸结构。MCM2、MCM4、MCM6、MCM7在Walker-B模序之后均有一个精氨酸锌指模序[6]，MCM蛋白C端有WH结构域，N端可延伸，可联合DNA并调节其极化、螺旋程序，所以MCM蛋白家族多以复合物的形式存在，如MCM4/MCM6/MCM7三聚体、MCM2/MCM4/MCM6/MCM7四聚体、MCM2～7六聚体等[7]。

1.2 MCM蛋白的功能

MCM蛋白在静息细胞中不表达，在有丝分裂开始时升高，在G1/M期下降。MCM蛋白与其他物质协同作用于DNA，形成复制分叉，参与DNA的合成。在有丝分裂细胞中，DNA复制程序的开始分为：(1)复制前复合物的构造：在有丝分裂晚期至G1初期，起始识别复合体与基因的启动子结合，将MCM2～7六聚体联合到DNA复制的起始点组成复制前复合物；(2)形成具有复制活性的复制叉：到S期时，复制前复合物被细胞周期蛋白依赖性激酶及CDC7/DBF4激酶(DDK)活化后，MCM蛋白复合物具有解螺旋酶活性，在复制起始点将双股DNA链打开，形成双向复制叉，DNA开始复制[8]。MCM2可能具有促进DNA复制的功能，使复制前复合物与染色质分离，负反馈抑制DNA的再次合成，从而对DNA的复制进行精确调控[9]。MCM4的锌指结构参与了三聚体的亚基相互作用，MCM6在ATP结合过程发挥重要作用，MCM7通过与其他亚基相互作用来促进MCM蛋白复合物的DNA解旋酶活性[6]。MCM8、MCM9形成复合物参与DNA同源重组，具有抵抗DNA损伤的作用[10]。MCM1通过与Bck2相互作用，激活细胞周期所需的初始基因组[11]，MCM10的C端与MCM2～7六聚体结合并相互作用，参与CMG复制解旋酶的激活[12]。

2 MCM蛋白与消化系统肿瘤

2.1 食管癌

黄晓平等[13]发现MCM4在正常上皮中不表达或弱表达，在食管恶性病变中表达明显高于正常上皮，并且与早期食管恶性肿瘤相比，MCM4在晚期食管恶性肿瘤组织表达量有明显上升趋势。Choy等[14]研究了食管腺癌、鳞癌和癌前病变中MCM4和MCM7的表达与Ki-67表达的相关性。通过实验得出MCM4、MCM7和Ki-67平均表达率依次为鳞状上皮(5.5%、7.3%和5.9%)、柱状细胞化生(11.2%、13.5%和3.4%)、Barrett食管(27.7%、35.3%和8.3%)、低度不典型增生(42.6%、52.2%和12.9%)、高度不典型增生(63.2%、77.7%和29.6%)、腺癌(61.3%、75.5%、24.5%)、鳞癌(74.1%，85.4%和36.3%)。MCM4和MCM7表达率明显高于Ki-67表达率，进一步分析发现MCM4的较高表达与腺癌组的淋巴结恶性变和较短的生存期存在关联。MCM4可能成为评价食管病变的敏感的标志物。

Sirieix等[15]探讨了MCM2预测Barrett′s食道、食道腺癌危险性的可行性。MCM2蛋白在正常食道、胃和十二指肠的管腔表面均未检测到。在Barrett′s食道中，食道上皮细胞中MCM2蛋白与异型增生程度高度关联(P<0.0001)。在食道腺癌的患者中，异型增生前活检组织中MCM2蛋白的表达高于对照组(阳性细胞平均表达率分别为28.4%和3.4%，P<0.0001)。在前瞻性队列中，异型增生或食道腺癌的组织病理诊断与MCM2蛋白阳性刷检的符合率为91%(P<0.005)，与回顾性研究中MCM2蛋白表面表达的例数相关(P<0.0001)。Huang等[16]评估MCM2蛋白作为生物标志物的潜力，将其与增殖细胞核抗原和Ki-67在食管鳞癌人群中进行比较。与增殖细胞相关抗原和Ki-67相比，MCM2蛋白检测食管异型增生的敏感性和特异性更高。MCM2蛋白可用于异型增生和食道腺癌的检测，也可用于检测有可能发展为异型增生和食道腺癌的患者。MCM2蛋白免疫染色结合表面刷检在人群中筛查食管癌高危患者可能是有价值的。

2.2 胃癌

Liu等[17]用Ki-67、MCM2蛋白和PCNA抗体对胃癌和相应的癌前病变组织进行免疫染色。发现癌前病变组织中90%表达MCM2蛋白，而Ki-67和PCNA分别表达67%和80%。MCM2蛋白预测癌变的敏感性和阴性预测值分别为90%和87%。Ki-67和PCNA的标记指数(LI)较低。LI(MCM2)，LI(PCNA)与TNM分期、淋巴结转移和GCC分级之间存在显著相关性(P<0.05)。MCM2表达增加与总体生存率和无病生存率降低相关(P<0.05)。荣芳等[18]发现浅表性胃炎、胃溃疡、慢性萎缩性胃炎和胃恶性肿瘤中的MCM4表达依序升高。MCM4可以分辩正常组织、不典型增生组织和肿瘤组织。Giaginis等[19]在对66例胃腺癌患者肿瘤标本研究中发现MCM5的表达与肿瘤大小(P=0.0295)、有无淋巴结转移(P=0.0216)和肿瘤组织学分期(P=0.0098)明显关联。MCM5高表达病人生存期明显缩短(P=0.0042)，MCM5的高表达与胃腺癌病人临床病理存在相同趋势，与较短存活时间存在联系。谭宁平等[20]在84例胃癌组织及癌旁正常组织中发现MCM8在胃癌组织中的阳性率为92.9%，在癌旁正常组织中阳性率为45.2%，差异有统计学意义(P<0.001)。MCM8在胃癌组织中的异常表达与组织分化程度及浸润深度相关(P<0.05)，在胃癌组织中表达阳性者总生存期低于阴性者(P<0.05)。Guo等[21]通过使用ONCOMINE、GEPIA2、UALCAN、癌细胞系百科全书(CCLE)人类蛋白图谱、Kaplan-Meier绘图仪、cBioPortal、GeneMANIA和MMP发现MCM1/5/7是胃癌患者精确治疗的潜在目标，MCM4/6/9是胃癌预后的新生标志物。MCM蛋白有作为胃癌中的诊断和预后标志物的潜力。

Wei等[22]发现MCM7在9个胃腺癌细胞系中均呈表达升高。MCM7蛋白在肿瘤组织中的表达高于相应的非肿瘤胃组织。在弥漫型胃腺癌中，MCM7蛋白表达与年龄高、疾病特异性生存差有关，与肿瘤分级、分期、淋巴结恶性变等临床病理因素无关，MCM7蛋白高表达与预后不良有关，说明MCM7蛋白的表达有可能成为弥漫型胃腺癌的生物标志物及预后指标；在正常胃上皮组织中，MCM7蛋白仅在增殖期间表达。用siRNA敲除胃恶性肿瘤细胞系AGS和NCI-N87中MCM7蛋白可明显抑制细胞增殖，减少单层集落形成，细胞侵袭能力衰减，促进晚期凋亡。RNA干扰可抑制MCM7蛋白在胃癌中的致瘤性，也可能会成为新的治疗靶点。

2.3 肝癌

Liu等[23]研究MCM参与肝癌的发生和肝细胞癌的预后。定量聚合酶链反应(qPCR)用于105个样品(正常肝15个)，肝硬化肝(40个)和肝细胞癌(50个)中，并鉴定出MCM2-7、MCM8和MCM10在肝癌中显著上调，MCM6独立预测了175例肝细胞癌患者的生存期，表达量越高，生存期越短，MCM6被认为是S/G2细胞周期进程的驱动力，也是肝细胞癌中潜在的诊断和预后标志物。

Yan等[24]研究发现通过上调MCM3、MCM4在肝细胞中的表达而导致细胞周期的抑制，从而达到抑癌的作用，为肝癌的化学防治提供依据。Nan等[25]探讨了细胞周期途径基因多态性与肝细胞癌发病风险的关系。调查新诊断肝细胞癌1 127例病例和1 200例非肿瘤患者的相关人口学、行为信息及血液学资料进行分层分析。最终发现MCM4可能与肝癌的发生有关。Liao等[26]利用生物信息学方法对MCM基因的生物学功能进行研究，使用GSE14520和肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的肝癌患者数据，发现MCM2～7基因在DNA复制和细胞周期中显著富集，并共表达，MCM2-7基因在肿瘤组织中的表达增加；在GSE14520队列中的生存分析表明，MCM2、MCM4、MCM5和MCM6的表达与乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌总生存期(OS)显著相关，在GSE14520队列中，MCM基因与无复发生存率无关。TCGA的验证队列提示MCM2、MCM6和MCM7的表达与肝细胞癌OS显著相关。由此可知MCM2-7基因可能是肝癌病人潜在的诊断生物标志物。MCM2和MCM6或许是肝细胞癌潜在的预后标志物。

2.4 大肠癌

Ishibashi等[27]探讨了MCM在结直肠恶性病变中的表达及与其预后的关系。发现在Dukes A和B期患者中，MCM7阳性和阴性患者的OS和无复发生存期(RFS)均无明显不同；在Dukes C期患者中，与MCM7阴性相比，MCM7阳性患者的OS和RFS明显更差。Nishihara等[28]对5种人大肠癌细胞系进行了蛋白质印记分析，并对202例手术切除的DukesB、C期大肠癌组织进行了免疫组织化学染色，对肿瘤标本进行免疫荧光双标记，以鉴定MCM阳性而Ki-67阴性的肿瘤细胞。5种细胞系均检测到MCM蛋白。MCM7和MCM2在几乎相同的肿瘤细胞群中共表达，而MCM7阴性但Ki-67阳性的肿瘤细胞在双标标本中除有丝分裂细胞外均无表达。多因素Cox回归分析表明，MCM7高、中位LI>58.1%是独立预后因素(RR=2.12，P=0.02)。以上证明MCM7有作为大肠癌预后相关肿瘤标记物的潜力。

Giaginis等[29]从96例结肠癌组织切片上进行MCM2和MCM5的免疫组织化学表达，发现MCM2与肿瘤组织学分级(P=0.003)、是否淋巴结恶性变(P=0.003)、肿瘤恶性程度(P=0.029)、血管侵犯(P=0.010)显著相关，MCM2的表达与Dukes分期有关(P=0.005)，未发现MCM5与这些病理性状显著相关。MCM2和MCM5存在相关性(r=0.745，P<0.001)与Ki-67呈显著正相关(r=0.963，r=0.738，P<0.001)。以上说明MCM2与MCM5均与结肠癌细胞增殖相关，只发现MCM2蛋白与结肠癌患者的重要临床病理密切相关。

Scarpini等[30]对54个肛门组织样本进行了初步的免疫组织化学研究，并使用144例受试者的235个肛门细胞样本进行独立前瞻性队列研究，结果发现从正常肛门上皮到肛门上皮瘤变(AIN)到肛门鳞状细胞癌(SCC)过程中，MCM2和MCM5的表达增高，包括在肛拭子采集的大部分细胞来源的浅表上皮第三层。AIN2/3和SCC中MCM2和MCM5的中位LI分别为90.2%和84.0%。MCM蛋白能够提高肛周细胞学标本中AIN和SCC检出率。MCM蛋白是恶性表型和癌前病变的细胞进入非调控周期的准确标志物。

2.5 胰腺胆管癌

Abe等[31]为提高内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)刷检细胞学诊断腺癌和反应性上皮改变的敏感性，对53例患者(良性13例，恶性40例)的ERCP标本进行MCM2和p53的免疫细胞化学检测，MCM2的LI为25%，p53的LI为10%。免疫细胞化学检测MCM2和p53的敏感性分别为90%和68%(P<0.05)。Margaret等[32]前瞻性地将97例胆管狭窄患者纳入研究，其中50例为恶性狭窄，在ERCP上采集胆刷标本检测MCM5，恶性肿瘤的敏感性为65.4%，细胞学的敏感性为25.0%。在72例胆刷细胞学与MCM5配对检测的患者中，MCM5检测恶性肿瘤的敏感性(55.6%vs.25.0%，P=0.0002)有所提高。说明MCM蛋白在ERCP刷检细胞学诊断胰胆恶性肿瘤可能有临床应用前景。

Liao等[33]从TCGA数据库获得112例接受胰十二指肠切除术的早期胰腺导管腺癌患者的RNA测序数据集。通过搜索公共数据库，观察到MCM蛋白(MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7)在胰腺癌组织中表达上调，并且它们之间存在强阳性共表达，其中MCM4可能是通过参与DNA复制、细胞周期、肿瘤蛋白p53和Notch信号通路等多个生物学过程和途径，从而影响胰腺导管腺癌患者的预后。Peng等[34]根据TCGA数据库提供的数据发现MCM1-10在胰腺癌中普遍存在，MCM2、4、6、8和10的过表达与较短的无病生存期显著相关，而MCM2、4、8和10的过度表达与OS较短相关。MCM蛋白可能被视为胰腺癌相关预后和治疗的标志物。

综上所述，通过MCM蛋白在人消化系统肿瘤中的研究，证明MCM蛋白能反映细胞增殖能力。可通过MCM的表达效果来区分正常组织、不典型增生组织和肿瘤组织。MCM可作为一种特殊的细胞增殖标记物，在临床消化系统肿瘤的早期诊断、分级及预后等方面发挥参考作用。

3 小结与展望

MCM蛋白已经引起众多研究者关注，在消化系统肿瘤中，MCM蛋白表达增高。在临床上检测MCM蛋白对恶性肿瘤的诊断、评价预后、早期筛查有着重要意义，MCM蛋白可能成为一种更具指导意义的标志物。MCM蛋白也可能作为抗癌药物靶点，因为它们是必需的DNA复制因子，在恶性肿瘤细胞和癌前细胞中高表达，但在分化的体细胞中表达下调[35]。目前缺乏恶性肿瘤中MCM蛋白作用机制的相关研究，王蕾等[36]成功构建MCM6重组质粒，实现了重组蛋白表达，为我们将来进一步研究MCM蛋白的结构与功能、MCM家族各蛋白间及细胞增殖期间的联系奠定基础，为肿瘤发生发展、治疗、预后等方面提供了更为广阔的思路。