伤口愈合过程中的干细胞动态变化

张慧聪，周文翘，章婷婷，胡常红

(重庆医科大学附属口腔医院全口义齿诊疗室/口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室/重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆，401147)

1 平衡状态下的皮肤干细胞

皮肤损伤的修复需要一系列过程，包括止血、血管生成、再上皮化和细胞外基质重塑。这其中有许多皮肤干细胞的参与，包括毛囊间表皮干细胞、毛囊干细胞、毛囊漏斗部细胞、皮脂腺导管细胞等。这些细胞在伤口发生时，可以转变为表皮干细胞，加速伤口的愈合并且促进皮肤附属器的再生。谱系分析表明，皮肤中的新生毛囊是来自于毛囊干细胞小生境之外的表皮细胞，即毛囊间表皮，这表明伤口中的表皮干细胞具有毛囊干细胞的表型。毛囊间表皮由单层增殖性基底细胞和数层分化的非增殖性细胞组成。基底细胞可以作为终末分化的角质形成细胞的补充细胞。在小鼠模型中，基底细胞迁移到皮肤表面大约需要1周的时间，而补充整个毛囊间表皮需要大约1个月的时间[1]。早期的增殖动力学实验表明，毛囊间表皮是由包含干细胞和祖细胞的小增殖单位维持。毛囊间表皮稳态是由一群定向祖细胞维持的，它们以随机的方式平衡更新和分化[2,3]。但是，进一步的研究表明毛囊间表皮干细胞可以维持更加静止的状态，持续时间更长，并且可以产生循环更短，寿命更短的祖细胞[4]。

2 伤口愈合过成中的干细胞

皮肤组织具有替换凋亡细胞和治愈伤口的天然能力。这种能力存在于常驻干细胞当中，它们会在皮肤表皮和其附属器受到来自外部环境的日常袭击时，保持稳态并在受伤后进行自我更新，保存和修复[5]。在伤口愈合过程中，干细胞被激活并向不同的皮肤区域迁移。在修复过程中皮肤干细胞会瞬时失去谱系限制和空间限制，从而允许多个表皮干细胞发挥作用[6]。

毛囊干细胞位于毛囊凸起处，受伤后，毛囊干细胞会从毛囊凸起处迅速迁移到伤口，这将有助于表皮的修复。稀薄的毛囊干细胞在伤口愈合过程中具有很高的可塑性，与其在移植后的最终结果相似[7]。但是Cotsarelis[8]等人在小鼠受伤前将毛囊干细胞进行标记，然后建立皮肤缺损模型，之后观察到毛囊干细胞迁移到伤口中心，但这种现象并没有持续存在，最终只有3%的新生毛囊是被标记的。这说明了非毛囊干细胞是新生毛囊的主要来源。为了进一步研究再生毛囊的起源细胞，使用了Krt1-15-CrePR *;R26R转基因小鼠，在受伤之前将大约70%的毛囊干细胞和50%的非毛囊凸起的表皮细胞标记，受伤后，大约一半的再生毛囊拥有表达lacZ的细胞（非毛囊凸起的表皮细胞的标记物），表明新的毛囊形成需要多种表皮细胞[8]。这些研究表明新的毛囊起源于毛囊干细胞生态位以外的细胞。

对毛囊间表皮干细胞的克隆分析表明，在小鼠尾巴皮肤损伤后，毛囊间表皮干细胞会被募集到伤口处，可以帮助表皮修复并持续长达35天[4]。但是，从长远来看，毛囊间表皮干细胞群体仅在其起源区域长期存在，而不会在伤口愈合过程中其所迁移到的位置长期存在。这些观察结果表明，在修复过程中，所有基底细胞均表现出一定程度的可塑性，基底细胞虽然可以在伤口发生时迅速迁移到伤口中心促进伤口的愈合，但基底细胞最终会保留其原始位置的记忆，而长期停留在原始位置。与毛囊干细胞相似，毛囊峡部表达Lrig1和Lgr6的干细胞在受伤后会动员起来，并且可能比毛囊干细胞活化得更快。但毛囊干细胞在再生过程中会迅速丢失，仅用作瞬时绷带，使毛囊间表皮和毛囊峡部/漏斗部中的其他干细胞能够长期维持修复状态[9]。在表皮损伤后，来自凸起的干细胞被募集到表皮中，并以线性方式向伤口中心迁移，最终形成明显的放射状。值得注意的是，尽管凸起处的细胞也具有表皮表型，但多数在数周内从表皮中清除，这表明凸起处的干细胞通过对急性伤口产生短时的“瞬时扩增”效应以应对皮肤伤口的急性修复。无毛的皮肤（例如爪子的腹侧或掌侧）会比人的皮肤动力学愈合发生的更慢，这表明毛囊干细胞对于伤口的愈合是必不可少的[10]。总而言之，由创伤所产生的皮肤缺损可广泛激活干细胞，使其呈现出不同于其稳态作用的特征。

3 伤口愈合过程中的干细胞的招募，迁移

通常表皮损伤后角质形成细胞增殖增加。有趣的是，在伤口边缘未观察到细胞的增殖，而是在伤口周围，距边缘0.5-1.5 mm处的增生区处观察到增殖[11,12]。在伤口的最前沿，角质形成细胞不会增殖，而是以细胞片的形式迁移[11,12]。表皮细胞在受伤后12小时内开始迁移到伤口床中。受伤后的第二天，靠近伤口的毛囊间表皮细胞朝着伤口的方向呈细长形，并且处于静止状态，而远处的细胞开始增殖。在这个区域之间，可以观察到包含迁移细胞和增殖细胞的混合区域。在这个混合区域中，基底细胞向伤口拉长，并在该方向定向分裂。在表皮中，最初存在于前缘的细胞会平行于伤口的方向而被拉长，这表明细胞会主动迁移，但在伤后2-4天呈垂直方向，这可能是因为它们被后面的细胞推动和压缩[11]。总而言之，这些观察结果提示，在受伤后的前沿首先会发生细胞迁移，接着该区域中的细胞移位会触发细胞的定向分裂。细胞增殖的增加本身可以产生更多的迁移细胞，这些迁移细胞随后将前沿推向伤口中心。

受伤后的第四天，前沿细胞被压缩并上调促进炎症和再生的特定基因的表达。最前沿的细胞瞬时表达较高水平的基质金属蛋白酶，促炎分子，控制细胞骨架的基因，微管和肌动蛋白，ECM配体和细胞粘附分子，例如整联蛋白α5。前沿的恒定大小及其与伤口大小或皮肤区域的独立性表明，控制标记物的表达信号是局部的，并可能在表皮内的细胞之间传播。前沿可以充当瞬时支架，实现和谐的伤口愈合。通过分泌更高水平的蛋白质来控制ECM重塑和血凝块溶解，伤口前沿可能会促进组织的再生朝伤口中心发展，并保护干细胞及其后代免受组织重塑[13]。

4 干细胞的种群动态

在稳态过程中，毛囊间表皮细胞在种群水平上不对称分裂，以维持恒定数量的表皮细胞[14]。然而，在伤口愈合期间，需要增加细胞数量以补偿丢失的细胞，直到重新上皮化的完成。可以通过增加对称性更新或减少细胞分化的比例来实现过度更新，而不是过度分化。对K14-CreER（毛囊间表皮细胞和祖细胞）和Lrig1-CreER（漏斗干细胞）小鼠品系的克隆分析表明，单个毛囊间表皮或漏斗细胞（基底层和基底层以上）产生的标记细胞条纹向着伤口中心[11]。不管它们的最初位置如何，伤口似乎都能诱导少量干细胞的活化。

5 干细胞可塑性

当来自毛囊和毛囊漏斗部的干细胞在受伤时被募集到毛囊间表皮时，它们逐渐失去其最初的特性，而被重新编程为毛囊间表皮干细胞的命运[9]。然而造成这种可塑性的分子机制仍不完全清楚。在比较受伤的毛囊间表皮和稳态中的毛囊干细胞和毛囊间表皮干细胞的染色质分布时，受伤的毛囊间表皮在毛囊干细胞和毛囊间表皮干细胞之间表现出杂交特征，其中开放的染色质区域富含毛囊间表皮干细胞（Klf5）和毛囊干细胞（Sox9）转录因子。这个混合阶段似乎确保了表皮屏障的正确重建[15]。这种混合状态在修复过程中是短暂的，但在皮肤癌中持续存在的[15,16]。

受伤后分化的表皮细胞能够恢复到干细胞状态[17,18]，这在气道上皮中也观察到此类现象。但是，基底毛囊间表皮细胞的谱系追踪表明，这些细胞在伤口愈合条件下不能再次回到基础状态[11,12]。相反，位于毛囊峡部的表达Gata6的细胞在稳态条件下会产生皮脂腺管，可在伤口愈合期间动员并向受损的毛囊间表皮迁移，并从分化的干细胞转变为基底干细胞[19]。这种损伤不会在受伤后立即发生，因为基底细胞需要几天的时间才能进入基底层并进行干细胞重编程[19]。与皮肤相似，肠道上皮中负责终末分化的细胞也可以恢复为祖细胞样状态，并在损伤后促进组织修复[20]。但是，需要肠道干细胞来确保电离辐射后的组织修复[21]，这表明，尽管定向祖细胞具有恢复干细胞的能力，但正常的组织驻留干细胞对于修复仍然至关重要。

创伤程度还可以影响细胞的可塑性。在相对较小的伤口中，皮肤重新上皮化而没有重新形成毛囊，而在大伤口中则明显出现了重新发育的毛囊。谱系追踪证实，这些重新发育的毛囊不是源自毛囊干细胞，而是源自毛囊间表皮细胞[13]。这类似于胚胎发育过程中毛囊的形态发生。

6 展 望

在过去的十年中，已将皮肤伤口愈合的重点放在了细胞疗法上，包括将各种细胞和生物活性因子掺入到支架中实现细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，从而实现完整的组织再生。关于伤口愈合还应致力于借助尖端技术和分子信号传导途径的知识，进一步激励研究人员将来开发有效的伤口护理疗法。最近出现的新技术展现了伤口特异性治疗方法的新途径和策略。各种基因编辑工具，材料科学工程学和跨学科科学的共同努力，对改变当前情况具有巨大潜力。随着生物医学科学的新技术发展，皮肤再生和修复的持续改进正在以更快的速度进行。再生医学及其相关临床研究的未来趋势可能会为新的治疗方法打开大门，这可能会带来伤口的无痛，快速和无疤愈合。