肝脏疾病类器官模型的研究进展

林允祯，王经琳，任昊桢，施晓雷

（南京大学医学院附属鼓楼医院 普外科，江苏 南京 210008）

将胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）或来源于组织的干、祖细胞通过三维培养技术进行体外培养获得的细胞簇被称为类器官[1]。类器官相较于传统二维细胞培养及动物模型试验有着独到的优势，随着细胞外基质研究的加深以及新型支架材料的出现，体外三维培养能够更加接近细胞在体内生活的环境。同时，类器官无需面临传统实验动物研究中存在的物种差异问题。目前关于胃[2]、脑[3]、肝脏[4-5]等多种器官体外类器官构建已相继有报道。除此之外，类器官还可应用于模拟肿瘤等疾病的发生发展[6-7]以及药物敏感性的检测等研究[6，8]。

肝脏是人体内最大的代谢器官，可以合成胆汁、蛋白质等物质，同时在免疫、代谢、凝血等多方面都发挥功能，研究肝脏的生理及病理状态有重要意义。传统的研究方式是通过肝细胞体外培养以及小鼠模型实现，随着原代肝细胞获取难度大、体外培养增值能力差且细胞极性不能长期维持等问题的暴露，传统培养模式不能满足肝脏实验的需求，肝脏类器官的出现较好弥补了其不足。目前肝脏类器官可以应用于构建正常肝脏模型，并且具有形成肝脏内复杂管道结构的能力[5，8-9]，同时也可应用于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染[7，10]、肝癌发生发展[6，11]等肝脏疾病相关的研究。本文主要阐述肝脏类器官构建的方式以及类器官在肝脏疾病中的应用。

1 类器官的构建

1.1 细胞的选择

理想的构成类器官的细胞需要具备自我更新的能力，以及能够被诱导分化成为其他不同类型的细胞。基于此，ESCs、iPSCs，来源于组织器官的干、祖细胞则常被选择成为构建类器官较为常见的种子细胞。

ESCs多取自囊胚期的内细胞团，分化潜能较高，并且由于早期缺乏表观遗传，组织相容性抗原不表达，因此不存在排斥反应，可以进行异体移植，理论上是构建类器官较为理想的材料。日本科学家山中伸弥通过将四种转录因子导入已分化的体细胞，使其发生重编程，重新转变为具有分化潜能的iPSCs[12]，而对重新获得分化潜能的细胞可再次进行诱导分化，获得满足需求的细胞。由于诱导iPSCs来源不涉及胚胎，伦理争议较小，目前在研究领域应用广泛[13]。而来源于组织器官的干、祖细胞培养方式相对便捷，能诱导分化成为特定组织来源的细胞，针对性较强[14]。

尽管理论上存在着多种选择，但是不同细胞仍有其局限性所在，ESCs不能排除可能存在的致畸风险，且需要面临伦理争议等问题[13，15]。体细胞在经历重编程时有可能造成基因组稳定性发生变化，并且由于存在表观遗传修饰，iPSCs在针对肝癌等表观遗传机制发挥重要作用的疾病的应用仍需要进一步讨论[1]。成体干、祖细胞面对的问题则是细胞分化面窄，仅能分化成为与来源组织较为接近的一种或几种细胞。对于类器官种子细胞的选择，仍需要考虑到实验需求以及细胞限制等诸多问题。

1.2 培养结合载体

三维培养过程中，“细胞基质”与“细胞沟通”发挥重要作用[16]，支架能够提供适合细胞生长的微观结构。理想的细胞支架可以促进细胞生长与黏附，包含维持细胞活力的营养环境，并且生物降解速率与细胞在新环境中基质沉积速率相类似[13]。

根据支架来源不同可分为合成聚合物支架与生物聚合物支架，前者有较成熟的合成工艺，机械强度高，价格低廉；而生物聚合支架具有较好的生物活性，能够更好促进细胞和组织之间的相互作用[17]。目前脱细胞支架，水凝胶等细胞支架已经应用于各类三维培养系统中。脱细胞支架是指利用洗涤剂或酶制剂将离体组织器官内细胞除去，同时保留器官基本外形、管道结构、胞外基质、细胞因子等[18]。由于细胞生活环境动态多变，目前模拟培养环境仍不能完全反映真实的人体内环境，脱细胞支架在这一方面具有天然优势，能够极大程度保留细胞生长环境中的各种组分，同时提供管道结构用于支撑以及物质的传递。天然的水凝胶可以从胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖等聚合材料中获得，含水量高，生物相容性和天然组织类似，毒性较低，种植在水凝胶中的细胞可均匀分布在水凝胶各处。在起到支撑作用的同时，可溶性的细胞因子还可通过水凝胶向细胞传递。目前，水凝胶支架材料已广泛应用于骨、软骨、血管等组织工程[13]。随着材料学、3D打印技术等的发展，新型支架也不断出现。聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯等材料已经应用于支架的合成，Ng SS 等[16]利用聚乙二醇丙烯酸酯用于胆管类器官构建。而另一种新型聚合材料支架，聚（3-羟基丁酸-3-羟基戊酸-3-羟基己酸）[Poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBVHHx]支架在电镜下可观察到不同孔径的蜂窝状结构，随着温度的调整可以改变孔径的大小，基于此构建的肝脏类器官对于肝衰竭小鼠有较好的治疗效果[15]。石墨烯具有疏松多孔的特性，便于氧气的运输，同时机械强度大，生物降解性良好，以石墨烯为材料的 支架已经在心脏、软骨、神经元等组织工程中取得了一定成果[19]。单纯的合成支架缺乏促进细胞粘附、生长的条件，往往需要在支架表面涂布细胞外基质蛋白，相较于层黏蛋白，纤连蛋白等其他常见细胞外基质蛋白，I型胶原能够更好促进细胞粘附在支架上并且进行增殖，是合成支架中较为常见的表面涂布材料[16，20]。综上，细胞支架的选择依赖于类器官构建的功能需求。

1.3 细胞因子及共培养

类器官培养过程中需要根据实验需求不断改变培养基条件，可以引入不同的细胞因子诱导细胞进行增殖或者定向分化。类器官构建早期阶段，需要诱导细胞增殖，获得足够的细胞量以进行下一步实验，在细胞培养基中引入表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、Wnt信号通路相关调节因子如Wnt3A、R-spondin 1（RSPO1）可有效促进细胞增殖。之后根据实验需求诱导细胞进行定向分化，引入骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），地塞米松等细胞因子可将增殖的细胞向肝细胞方向诱导分化[21-22]，HGF、EGF、FGF、RSPO1等因子的引入可以使细胞在体外扩增数个月，且细胞可同时表达肝和胆管相关的标志物，进一步在培养基中引入BMP与地塞米松之后，可以观察到白蛋白（albumin，ALB）、α1-抗胰蛋白酶等肝细胞相关标志物表达的提升，提示加入的诱导因子促进增值的细胞向肝细胞进行转化[22]。改变诱导条件，在分化培养基中加入一定量mTeSR培养基则可将增殖细胞向胆管细胞方向诱导[5]。

除了引入特定的细胞因子诱导细胞进行分化以外，还可以通过细胞共培养的方式诱导细胞分化，将间充质干细胞与肝细胞共培养4 周可获得具有肝细胞功能的肝样细胞，而肝细胞损伤后释放的细胞因子也可促进间充质干细胞向肝细胞转化[15]。共培养不仅提供了细胞生长分化所需的细胞因子，同时也促进类器官的形成与复杂结构的产生，星状细胞与肝细胞共培养过程中，肝细胞聚集在星状细胞周围形成细胞团块，而进行单细胞培养的肝细胞大多以散在形式存在[20]。iPSCs、内皮细胞、间充质干细胞的共培养能够诱导肝芽组织形成并且能够快速血管化，复杂管道结构能够进行营养物质、细胞因子及代谢废物的传递，对较大体积类器官的构建、研究发生于内皮层面的生理病理过程等方面有着重要意义[8，23-24]。

2 不同肝脏类器官的构建

2.1 正常肝脏类器官

肝脏有较强的再生能力，当肝脏发生损伤时，门静脉周围的肝细胞能够及时修复肝脏，而在有毒物质作用于肝脏细胞时，胆管周围细胞会扩增用于肝脏的修复，但损伤修复面临着阈值以及时间的限制。急性肝衰竭发生时，肝移植是目前唯一有效的治疗方法，但肝源短缺限制了肝移植疗法的临床应用价值。体外培养肝细胞则需要面临获取难度较高、原代肝细胞体外增值能力有限、长期培养过程中可能出现功能丧失等问题[20]。肝类器官由于体外培养过程中能够维持干性以及表现出特定器官的功能，作为肝移植替代疗法具有较大的应用前景。同时肝类器官能够弥补经典模型在肝脏代谢研究方面的局限，用于研究肝脏损伤、药物代谢及毒性反应。

肝脏类器官的构建通常需要扩增与分化两步，通过改变培养基的条件实现细胞的扩增或者定向分化，通过引入细胞因子扩增细胞并诱导分化至内胚层阶段，后根据需要进一步将其诱导成肝细胞[8-9，22]。除了引入特定的细胞因子以外，也可通过改变培养的条件诱导细胞分化，Mun SJ等[8]发现构建缺氧环境同样可以促进内胚层细胞向肝类器官分化。

正常肝脏除了肝细胞外，胆道系统也是肝脏组成的重要部分，肝细胞由内胚层分化而来，而胆管上皮细胞由中胚层分化，通过引入FGF、激活素A（Activin A）等因子，将诱导至内胚层的细胞进一步诱导至中胚层，并在胆管细胞培养基中进一步培养成为胆管类器官[5]。Wang S等[21]扩增ESCs并通过流式细胞术分选出上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）阳性的细胞，导入诱导因子培养两周后，镜下观察发现细胞形成空心管样结构，同时胆管细胞相关标志物细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、EPCAM、γ-谷氨酰胺转肽酶（gamma glutamyl transferase，GGT）等表达上调，肝细胞相关标志物如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、TBox3（TBX3）等表达下调，罗丹明123（rhodamine 123，Rho123）代谢实验检测胆管标志物多耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）提示阳性，表明类器官中具有较为成熟的胆管结构。

关于肝类器官或者胆管类器官的培养方法已有不同团队相继报道，但是如何在培养的组织器官中共同表达肝细胞与血管、胆管等复杂结构仍是目前需要解决的问题。有研究发现mTeSR培养基可能影响NOTCH和TGF-β信号通路影响肝类器官的分化过程，在将iPSCs诱导至内胚层阶段后，向培养基中加入25% mTeSR培养基促进部分内胚层细胞向中胚层转化，进一步促进细胞成熟可培养同时表达肝细胞与胆管结构的类器官[5]。

正常肝类器官获取简单，体外扩增便捷，能够长期保持细胞极性及功能，在基础实验及临床应用中有广泛前景，目前，针对药物代谢以及肝损伤后类器官治疗已有部分研究报道[25-26]。在临床前实验中，对猪进行85%肝切除构建肝衰竭模型后，通过三维培养猪肝细胞进行治疗，大部分治疗组的猪存活时间超过90 h，且体内代谢废物堆积水平明显低于对照组，而对照组存活时间在30～50 h，肝切除48 h后检测肝脏体积发现肝脏体积部分恢复，增殖相关标志物Ki-67表达上升[27]。而另一项关于灵长类动物实验中也观测到了类似的结果，利用α-鹅膏蕈碱及脂多糖处理30只恒河猴构建急性肝衰竭模型后，在猪肝类器官为基础的生物人工肝治疗下，恒河猴存活率明显提升，且免疫排斥反应弱，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素12（interleukin-12，IL-12）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等因子水平降低，炎性细胞在治疗后逐渐下降到正常水平，增殖相关标志物表达上升，肝脏损伤状况得到了明显改善[28]。

2.2 脂肪肝类器官

脂肪肝是常见的代谢性疾病，根据发病因素的不同可以分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，随着肝细胞脂肪变程度的加深，肝脏结构及功能受损，可进一步导致肝脏结构改变，引发肝炎、肝纤维化甚至肝硬化。将胎儿间充质细胞和ESCs共培养，构建的类器官可表达乙醇代谢相关酶如乙醇脱氢酶以及细胞色素P450超家族（cytochrome P450 proteins，CYP）成员CYP2E1，进一步使用乙醇处理类器官后，肝损伤标志物表达上升，并出现肝脂肪变性、纤维化、线粒体膜电位去极化等与乙醇肝损伤相似表现[21]。非酒精性脂肪肝受到多种因素调控，目前仍未完全阐明其发病机制，研究疾病的发生及发展有较大意义。肝细胞和肝星状细胞在肝纤维化过程中发挥着重要作用，将肝细胞与肝星状细胞共培养形成的肝类器官置于含有脂肪酸、棕榈酸、油酸的混合培养基中可以诱导脂质堆积以及胶原分泌，而抗脂肪变性和抗纤维化的药物如奥贝胆酸可减轻症状[29-30]。除代谢环境的影响外，相关基因的表达异常也可导致肝脂肪变性。小干扰RNA 122（microRNA-122，miR-122）在抑制炎症、坏死、脂肪变性方面有调控作用，在肝细胞和星状细胞共同构建的类器官中，抑制miR-122 可导致趋化因子配体2（chemokine ligand 2，CCL2）、趋化因子配体3（chemokine ligand 3，CCL3）、TNF-α、IL-6等炎性因子表达的上升，同时细胞发生脂肪变性和纤维化[31]。肝脂肪变性及纤维化受到遗传信号、代谢环境等多种因素的控制，类器官可为疾病研究提供一种便捷、可重复的实验模型。目前脂肪肝类器官应用于药物代谢模型较多，临床前研究及临床试验尚无报道。

2.3 乙肝类器官

目前中国仍是乙肝大国，HBV感染导致的肝硬化乃至肝癌仍是影响国人生命安全的主要因素之一。HBV感染存在明显异质性，部分人可表现为有限或者无症状的感染，而部分人则会发展成肝硬化甚至肝癌。经典二维细胞培养模式除了要面对细胞来源缺乏以及不能较好模拟体内环境的问题外，有限的增殖能力也导致病毒相关的遗传修饰不能保存，为进一步研究增加了困难[10]。类器官在长期保存、体外增殖、模拟细胞与组织器官间相互作用等方面具有优势，可以构建体外长期保存的HBV感染模型。

通过病毒感染类器官，感染相关蛋白的表达是关键，牛磺胆酸钠转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）可能是HBV侵入细胞的关键受体之一，有研究表明，在肝癌细胞系中过表达NTCP容易导致HBV的感染，并且已有团队通过HCV感染肝癌细胞系得到HCV感染模型[32]，但是相比于正常细胞系，肝癌细胞系中包括先天性免疫在内的多条引号通路缺失，这对病毒感染机制的研究造成一定影响[10]。合适的细胞则是成功构筑病毒感染模型的另一项要素，iPSCs具有较好的增值能力及分化潜能，是病毒感染类器官的良好细胞选择。Ng SS等[16]利用反相聚乙二醇支架培养iPSCs构建类器官，可表达与病毒侵袭及包装的相关蛋白，进一步利用病毒感染类器官构建病毒类器官模型。Kaneko S等[10]构建了由肝祖样细胞（induced pluripotent stem cell-derived hepatic progenitor cells，iPSHPCs）和分化肝样细胞（induced pluripotent stem-cellderived hepatocytes，iPS-Heps）两种不同细胞来源的感染类器官，Nie YZ等[7]利用iPSCs、骨髓间充质细胞、人脐静脉内皮细胞共同培养构建肝类器官，通过HBV感染成功构建乙肝类器官。由iPSCs构建的乙肝类器官能够弥补传统模型的不足，同时具备较完备的信号通路，能够满足对于HBV感染机体的研究，并可进一步针对其信号通路研究治疗药物及方法。

2.4 肝癌类器官

原发性肝癌是致死性恶性肿瘤之一，随着生活水平质量的提高，糖尿病、肥胖等危险因素增加，肝癌的发病率也在逐年上升。全基因组测序发现了肝癌患者存在大量基因突变，这对于人类理解肝癌的发生起到了很大帮助。然而，肝癌具体发生机制仍未完全阐明，传统二维培养模式下的肿瘤细胞无法实现细胞与细胞间、细胞与周围环境间相互交流的过程，通过三维培养的肿瘤细胞可以更准确展现出肿瘤细胞对肿瘤微环境的构建，反映出肿瘤发生过程中的真实过程，对肿瘤治疗靶点及药物筛选可起到一定指导作用[33-34]。

有研究团队筛选肝细胞肝癌及胆管细胞癌高突变基因并在构建的肝类器官中进行诱导表达，发现诱导肝癌高突变基因c-myc的表达导致组细胞形态更加无序，ALB表达下降，将类器官移植入实验小鼠后发现小鼠形成肝癌，而诱导胆管细胞癌高突变基因RASG12V在类器官中的表达后发现细胞形成黏液空泡样，SOX9、CK19 等胆管细胞相关标志物表达上调，提示该肝细胞向胆管细胞癌细胞转化[11]。将来源于肝细胞肝癌、胆管细胞性肝癌、胆管细胞癌的肿瘤细胞进行三维扩增培养，观察培养物形态，相比于健康肝类器官，肿瘤类器官表现出更加不规则的形态结构，肝癌标志物AFP和磷脂酰肌醇聚糖3（Gypican-3，GPC3）明显上升，而ALB、转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）、载脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）、载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）等肝脏标志物随着肿瘤来源的不同表达也存在差异，而不同来源的肝癌类器官对不同肿瘤药物的敏感性也有所不同，提示肝癌类器官在体外培养的条件下仍能保持和来源组织相同的性质[6]。体外培养的肝癌类器官能够保持高增殖能力的同时保持原有肿瘤的性质，为肿瘤研究提供了一个简便、稳定、可重复的实验模型。

3 小结与展望

类器官可以在极大程度上弥补传统研究方法上的不足，对于模拟肝脏的发生、损伤修复、疾病与机体相互作用、药物筛选等方面可以发挥重要作用。目前肝脏类器官在基础研究中已有一定研究基础，但是类器官的临床应用仍然面临着诸多挑战，距离完全成熟的人工肝脏仍有较长距离，对于复杂血管、胆管等的模拟仍然无法完美实现。目前类器官仍有较大的进步空间，在生命科学研究上有巨大的应用前景。随着材料学等相关学科的发展，相信相关问题会逐步被攻克，类器官会广泛应用于科研及临床的各个方面。