环状RNA在胆管癌中的作用机制及潜在应用进展

姚远，焦德超，陈建建，周学良，李亚华，李兆南，李静，刘灶渠，韩新巍

（郑州大学第一附属医院 放射介入科，河南 郑州 450052）

胆管癌是发生于胆管系统的恶性肿瘤，其发病率在全球呈上升趋势，目前约占所有原发性肝癌恶性肿瘤的15%，约占消化道恶性肿瘤的3%。作为一种上皮细胞恶性肿瘤，胆管癌可发生于胆道的不同部位，临床上根据解剖位置的不同将其分为肝内胆管癌、肝门周胆管癌和远端胆管癌，它们的临床表现也存在差异[2]。目前，手术治疗仍然是各种类型的早期胆管癌的首选治疗方式[3]。但由于胆管癌诊断相对困难且肿瘤自身的高侵袭性，胆管癌患者预后不良，诊断后患者的平均生存期仅为24 个月[4]。有研究显示，胆管癌的发生与胆石症、胆总管囊肿、胆管炎等多种危险因素密切相关[5]。此外，胆管癌复杂的分子机制和肿瘤微环境是当前探究胆管癌的热点，同时也为胆管癌未来新的诊断方式和治疗手段提供了理论依据[6]。近年来，非编码RNA在肿瘤中的重要角色逐渐被揭示，而环状RNA作为相对稳定的分子，更是在肿瘤增殖、转移等生物过程中起到至关重要的作用[7]。本综述旨在总结环状RNA分子在胆管癌发生发展中的作用机制，探讨其在未来临床应用（生物标志物和治疗靶点）的潜力，为胆管癌的诊治提供新的思路和观点。

1 环状RNA的产生和生物学特征

1976年Sanger首先在植物类病毒中发现了共价闭合的环状RNA；1979年Hsu通过电镜在HeLa细胞细胞质发现了类似的环状转录本，由此人们一直认为环状RNA只是错误剪接的产物。直至1993年，Capel发现小鼠Sry（sex-determining region Y）基因的环状RNA可能在小鼠睾丸发挥特定功能，环状RNA才真正进入科学研究领域的视野，并逐渐成为研究的焦点。Jeck WR等[8-9]提出了环状RNA的发生模型即套索驱动的环化（lariat-driven circularization）和内含子配对驱动的环化（intron-pairing-driven circularization）。它们生成的第一步是不同的：套索驱动的环化由外显子组成的剪接供体和剪接受体共价结合，而内含子配对驱动的环化则由2 个内含子互补配对结合，从而形成环状结构。而在接下来的步骤中，这两种模型的过程基本一致，即剪接体切除剩余内含子和形成环状RNA。2016年Chen等[10]课题组提出真核细胞中的环状RNA来源于mRNA前体（pre-mRNA）的反向剪接而成的。正是由于环状RNA通过头对尾的反向剪接方式产生，不含有帽子结构和polyA尾，所以其稳定性高于线性RNA，可耐受核酸外切酶的降解[11]。对于环状cRNA序列的研究常常借助高通量，基因芯片和生物信息学等技术，一系列新技术的诞生逐渐揭开环状RNA神秘的面纱[12]。

目前，认可度较高的环状RNA的生物学功能包括miRNAs的分子海绵、环状RNA调控转录和剪接、环状RNA与蛋白质相互作用以及部分环状RNA的编码能力[13-17]（见图1）。总之，环状RNA在生物学和病理生物学中具有重要的意义，同时在很多疾病的发生和发展过程中都发挥了重要的作用；基于对环状RNA更深层次的探索，研究人员开发出一系列新型的生物标志物和肿瘤靶点，有望实现临床转化，形成疾病诊断和治疗的新模式。但是，由于机制的复杂性，仍然需要进一步研究来揭示环状RNA分子在健康组织和疾病中的调控和功能。

图1 环状RNA的生成和功能[13-17]

2 环状RNA在胆管癌中的作用机制

胆管癌是临床上一种起病隐匿且诊治难度较高的恶性肿瘤，通常发现时即为晚期。错过早期根治性切除时机、缺乏敏感的早期肿瘤标志物以及对化疗不敏感等都成为胆管癌患者预后不良的高危因素。因此，了解胆管癌发生发展的机制，是开发新的生物标志物，寻找更有效的治疗靶点，增加放化疗敏感性的关键。

环状RNA 是一种特殊的封闭环状的非编码RNA，一系列研究已经证实，其在胆管癌增殖，转移等生物过程中起到了关键的作用（见图2）。Xu等[18]通过体外实验和体内实验探索了hsa_circ_0001649作为抑癌基因在胆管癌中的生物学功能，发现该环状RNA分子可以抑制胆管癌细胞的侵袭和转移，并能调节细胞周期继而促进肿瘤细胞凋亡。相反地，Wang等[19]证实了外泌体携带的Circ-0000284 是一种促进胆管癌细胞迁移、侵袭和增殖的促癌基因，miR-637 为其直接作用的下游靶分子，同时由肿瘤细胞分泌的携带大量该环状RNA的外泌体能促进作为受体细胞的正常胆管细胞向恶性转化。此外，很多研究已经证实环状RNA可以作为分子海绵，吸附miRNAs而影响肿瘤细胞的表型：Xu等[20]报道circ_0005230可以直接吸附miR-1238和miR-1299来发挥其促进细胞生长、克隆形成能力和转移特性，抑制肿瘤细胞凋亡的促癌功能；Li等[21]同样证实circRNACDR1as与miR-641结合，加速miR-641降解，继而激活AKT/mTOR信号通路，最终促进了胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在临床治疗中，胆管癌对于化疗不敏感，Lu等[22]通过对收集的92例行切除的原发性肝内胆管癌患者的肿瘤组织及邻近组织进行circ-SMARCA5检测，发现该环状RNA在肿瘤组织中低表达，同时通过随访发现circ-SMARCA5 上调的患者总生存期高于下调的患者（P=0.007）；此外在TFK-1和HuH-28细胞株中，上调circ-SMARCA5增加了顺铂和吉西他滨对胆管癌细胞的化疗敏感性，进一步体现该环状RNA的临床应用潜力。但是，对于化疗敏感性的研究仅局限于体外实验，需要更高级别的证据来证明其在化疗增敏中的作用。Moirangthem等[23]通过生物信息学技术预测了在胆管癌中高表达的circ2174可作为海绵调节miR149的表达，从而调节胆管癌中八聚体转录因子-2和白介素-16信号通路，但是并无相关基础实验验证。此外，有研究证实Circular RNA HIPK3，FOXP1和circERBB2可以促进胆囊癌的进展。见表1。

表1 环状RNA circERBB2、FOXP1、HIPK3在胆管癌中的作用机制

图2 环状RNA在胆管癌中的作用机制

总之，对于胆管癌机制的研究，尤其是对于环状RNA的研究虽然取得了一定的进展，揭示了部分胆管癌的增殖、侵袭、转移和凋亡等机制。但是，当前的研究仍然存在机制不深入，作用模式单一等问题。未来仍然需要借助更加高级的分析技术，通过深层次的、多组学的研究进一步揭开胆管癌神秘的面纱。

3 环状RNA在胆管癌中的临床应用潜力

大量研究已经证实，环状RNA在胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、胆管癌等多癌症里调控肿瘤细胞增殖和转移等多种生物过程[27-30]。基于对上述功能的总结，环状RNA不论是作为肿瘤标志物还是治疗靶点，都有一定的临床转化潜能[31]。Jiang等[32]研究了54 例胆管癌患者癌及癌旁组织中环状RNA Cdr1as的表达情况，评估了Cdr1as表达水平与临床病理特征的相关性以及其与总生存率及其预后疗效的关系，证实Cdr1as表达量与TNM分期、淋巴结浸润及术后复发密切相关并且多因素回归显示Cdr1as的表达可以作为胆管癌的独立预后标志物（敏感性83.3%，特异性58.3%）。circ-SMARCA5与肿瘤特征、生存状况及其对化疗敏感性的促进作用的相关性使其有望成为监测肝内胆管癌进展和预后的生物标志物。对于胆管癌的治疗，环状RNA也表现出一定的临床应用潜力——上述机制研究发现circ_0005230和Cdr1as促进肿瘤的增殖和转移，理论上通过抑制环状RNA的表达或者阻断其下游机制，可以抑制胆管癌的进展，因此，二者可能成为胆管癌新的治疗靶点[20-21]。与促癌基因不同，hsa_circ_0001649作为抑癌基因可以抑制胆管癌的增殖和侵袭，通过工程学技术，构建以该基因为核心的过表达载体在理论上能有效抑制肿瘤的扩散，以此有望开发出新型抗胆管癌的分子药物[18]。如何将环状RNA的研究应用于临床即在不产生任何副作用的前提下，实现分子靶向药物的设计和递送，使其在特定的组织上调或下调是实现基础研究向临床应用转化的关键。随着基础研究的深入和生物技术的发展，对环状RNA的机制研究也会越来越深入，我们应逐步制定基于环状RNA的治疗方案，开发出安全有效的临床应用药物，最终解决胆管癌相关的临床难题[33-36]。

4 小结与展望

胆管癌作为肝胆系统第二大恶性肿瘤，因其起病隐匿，诊断滞后，治疗效果差，预后不良等，一直是困扰临床医师的难题。因此，对于胆管癌增殖、迁徙和转移，化疗耐药，胆管癌肿瘤微环境以及肿瘤免疫等机制研究对于指导临床诊断和治疗有深远的意义，也有望弥补当前传统诊疗方法的不足。非编码RNA（ncRNA）是一大类由基因组转录而成的不编码蛋白质的RNA分子，环状RNA作为特殊的一类，其部分分子能编码多肽或者蛋白[15，17]。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性；同时，相较于线性RNA分子，环状RNA对核酸酶不敏感，这种独特的天然结构加强了其在组织和体液中的稳定性，这使得环状RNA分子在作为反映肿瘤状态和患者预后的生物标志物的开发应用上具有明显的优势。此外，环状RNA能在核内调控转录[37-38]；在胞浆中作为竞争性内源RNA（ceRNA）能竞争性结合miRNA，从而调控miRNA靶基因的表 达[39-40]等。近年来，有研究发现，环状RNA分子也可以装配到外泌体等囊泡性结构中，并通过体液运输到特定的受体组织并被摄取，继而激发受体细胞或组织一系列生物反应，承担起信号转递的作用，这在研究肿瘤侵袭和远处转移方面有深远的意义[41-42]。例如，在胆管癌细胞中circ-0000284被装配到外泌体中，介导了肿瘤细胞和正常胆管上皮细胞的通讯，使得摄取该外泌体的正常细胞向恶性表型转化[19]。总之，环状RNA在调控肿瘤细胞病理生理过程中发挥着巨大的作用，也可能在未来胆管癌和环状RNA分子二者关系的机制研究的基础上，开发出有效的新型抗癌分子药物。

在胆管癌中，环状RNA的研究也存在一定的局限性：（1）环状RNA的研究基础依赖于测序技术的发展，当前二代测序的测序长度在150 nt左右，不能一次读取环状RNA的全长序列；另外，后续筛选鉴定可能因为可变剪切而导致环状RNA的筛选识别出现假阳性[43-44]。最新的三代测序技术虽然能够读取全长，但是存在准确性不足的问题，应用并不广泛，未来需要更加准确有效的测序技术来弥补当前测序手段的不足。（2）相较于其他类型的非编码RNA，环状RNA研究起步较晚，相关的数据库较少；同时，生物信息学技术对于环状RNA的分析也存在一定难度，这些不利于基础实验的开展。（3）胆管癌所处的机体环境较为复杂，既存在血管的供应，又有胆汁的浸润，因此，胆管癌的调控过程较为复杂。

随着RNA技术的稳步发展，我们可以预见未来几年环状RNA在胆管癌中的研究将有一个巨大的发展，在克服当前研究所面临的问题的基础上，应逐步探索单细胞测序技术和多组学研究方法，更为全面、有效、科学地解释胆管癌的发病机制，并以此开发出针对于胆管癌的新型生物标志物和分子靶向药物，最终解决胆管癌相关的临床难题。