环状RNA在系统性红斑狼疮中的研究新进展

郭鹏威，尤燕舞

(右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种好发于育龄期妇女，可累及肾脏、血液、神经、皮肤等多器官及系统的自身免疫疾病。最近研究表明，环状RNA(circRNA)广泛参与了自身免疫疾病如SLE、类风湿性关节炎等自身免疫疾病的发病过程，在成人SLE患者的血浆、全血、外周血单个核细胞(PBMCs)或肾脏等组织中circRNA 表达异常[1]，另外在儿童SLE患者中circRNA表达也异常[2]。本文将circRNA在SLE患者中表达的研究新进展进行综述。

1 circRNA的功能及分类

circRNA是广泛并稳定存在于真核细胞中的一类不具有5′末端帽子和3′末端 poly(A)尾巴，并以共价键形成封闭环状结构的新型内源性非编码 RNA 分子[3-4]。这些特性赋予circRNA对核糖核酸酶(RNase)具有抗性，其半衰期超过48 h，故其较为稳定[5]。circRNA主要存在于细胞质中，circRNA的转录主要来自外显子、内含子、未翻译区或基因间区[6-7]。其通常由2～4个外显子组成，保留或不保留内含子。根据circRNA所包含的序列，circRNA可分为4类:①仅由外显子组成的外显子RNA(ecircRNAs)[5]；②内含子环状RNA(intronic circRNA)[7]；③同时包含外显子和内含子序列的环状RNA(EIciRNAs)[8]； ④来源于tRNA的环状RNA(TriRNA)[9]。circRNA 在自身免疫疾病中发挥着微小RNA(miRNA)分子海绵或竞争性内源 RNA(ceRNA)、与 RNA 结合蛋白(RBP)相互作用、翻译蛋白等生物学功能，影响着免疫细胞的生物学行为，从而促进或抑制自身免疫疾病的发生、发展，有望成为SLE治疗靶点。

2 circRNA在SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达

Luo Q等[10]研究表明，对50例新发SLE患者、24例新发类风湿关节炎(RA)患者、24例新发强直性脊柱炎(AS)患者和45例年龄性别相匹配的健康对照组(HC)的PBMCs的研究结果证实，SLE患者PBMCs的hsa_circ_0000479、hsa_circ_0082688、hsa_circ_0082689升高，而hsa_circ_0000175明显低于RA患者、AS患者和HC。这些已证实的差异表达circRNA的相关分析显示，hsa_circ_0000479与C3水平及处理相关，hsa_circ_0082688与抗dsDNA水平相关，hsa_circ_0082689与抗dsDNA水平、抗核小体频率及处理相关。通过对受试者工作特征曲线分析，hsa_circ_0000479在鉴别SLE与AS、RA、HC有显著价值。hsa_circ_0000479-抗dsDNA组合模型能有效区分SLE组和对照组(RA+AS+HC)，敏感性为86.00%(43/50)，特异性为100.00%(93/93)，准确性为95.10%(136/143)，研究结果提示，PBMCs中的hsa_circ_0000479和hsa_circ_0000479-抗dsDNA组合模型可能作为SLE诊断和疗效评估的潜在生物标志物。

Miao Q等[11]研究提示，circPTPN22的亲本基因为蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22 (protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)，SLE患者circPTPN22的下调与SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分呈强负相关，circPTPN22与诱发SLE的免疫调节相关的miRNAs和mRNA存在相关性；SLEDAI评分较高的患者circPTPN22表达水平较低，长期激素治疗可显著提高circPTPN22水平，ROC分析提示circPTPN22对SLE具有良好的诊断价值，该研究提示SLE患者的环状RNA表达与健康对照组相比存在异常，circPTPN22可作为SLE的诊断和评估病情严重程度指标。

Wang X等[12]发现circIBTK表达在SLE患者中下调，并与SLE患者疾病活动指数(SLEDAI)评分、抗双链DNA 和补体C3水平相关。然后miR-29b在SLE患者中表达上调，并与SLE患者SLEDAI评分、anti-dsDNA和补体C3水平相关。该研究表明，miR-29b可以诱导DNA去甲基化并激活AKT信号通路，而circIBTK可能通过与miR-29b结合逆转SLE患者中miR-29b诱导的DNA去甲基化和AKT信号通路的激活。SLE患者中circIBTK下调，可能通过与miR-29b结合调节DNA去甲基化和AKT信号通路。circIBTK和miR-29也可以作为SLE的生物标志物和治疗靶点。

Zhang CZ等[13]检测18例诊断为SLE患者和10例健康对照者PBMCs中hsa_circ_0049224、has_circ_0049220和DNMT1的表达。该研究结果发现，hsa_circ_0049224和has_circ_0049220在健康对照组的表达均显著高于未活动和活跃SLE患者。DNMT1的表达量与hsa_circ_0049224、has_circ_0049220的表达量呈正相关。此外，SLEDAI与hsa_circ_0049224和has_circ_0049220的表达呈负相关。该研究结果还发现这两种环状RNA与SLE的一些临床特征有关。该研究结论为hsa_circ_0049224和has_circ_0049220可能参与SLE的发病过程，在诊断SLE中具有潜在的临床价值。

3 circRNA在SLE患者血浆中的表达

Li HX等[14]研究提示，在SLE组及对照组血浆中，有207个circRNAs存在差异表达，其中有113个表达上调，94个表达下调。通过验证实验确定了4个circRNA，分别是:hsa:circ_102584、hsa:circ_400011、hsa:circ_101471和hsa:circ_100226，它们在SLE血浆中明确存在着异常调控，为SLE患者提供了潜在的生物标志物。

Zhang MY等[15]研究提示，与健康对照组相比，112个circRNAs在SLE血浆中被鉴定为表达异常；qRT-PCR结果显示，与健康对照组相比，SLE患者血浆和PBMCs中hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308的表达均下降。hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308在血浆中的受试者工作特性(ROC)曲线下面积分别为0.599和0.662。hsa_circRNA_407176、hsa_circRNA_406567和hsa_circRNA_001308在PBMCs的ROC曲线下面积分别为0.806、0.744和0.722。该研究表明，血浆和PBMCs中的hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308可能是SLE的潜在生物标志物。

Ouyang QQ等[16]研究59例SLE患者(30例LN患者和29例无LN患者)、26例类风湿性关节炎(RA)患者和27例年龄和性别匹配的对照者中所选circRNA的变化。这项研究结果表明，LN患者的血浆circRNA_002453与无LN的SLE患者、RA患者和健康对照组相比显著升高。与RA患者和健康对照组相比，SLE患者血浆circRNA_002453也被发现上调。在LN患者中，我们检测到血浆circRNA_002453与疾病活性(包括C3、C4)和SLE疾病活性指数2000(SLEDAI-2k)评分之间无显著相关性。而其表达水平与24 h蛋白尿和肾SLEDAI评分正相关。ROC分析显示circRNA_002453血浆曲线下面积为0.906(95%CI0.838～0.974，P<0.001)，鉴别LN患者与对照组(无LN的SLE患者、RA患者和健康对照组)的敏感性为0.900，特异性为0.841。约登指数最高为0.741，最佳截断值为0.001。该研究提示，LN患者血浆circRNA_002453水平升高与肾脏受累的严重程度相关，也可作为LN患者诊断的潜在生物标志物。

4 circRNA在SLE患者T细胞中的表达

Zhang CZ等[17]分离CD4+T细胞，利用circRNA芯片分析筛选CD4+T细胞中的候选circRNA；转染hsa_circ_0012919靶向siRNA后，检测DNMT1、CD11a和CD70的表达及CD11a和CD70的甲基化水平；hsa_circ_0012919的网络分析采用生物信息学方法；采用荧光素酶报告基因检测和FISH荧光原位杂交，检测筛选哪些miRNA可以与hsa_circ_0012919结合。结果提示，SLE患者组有12个circRNA表达上调，2个circRNA表达下调，证实hsa_circ_0012919在健康对照人群与SLE患者之间存在显著差异，并与SLE特征相关。下调hsa_circ_0012919，可以提高DNMT1的表达；降低CD70、CD11a的表达，可以逆转SLE患者 CD4+T细胞中CD11a和CD70的DNA低甲基化，但下调DNMT1可以逆转。该研究认为hsa_circ_0012919可以被认为是SLE的生物标志物，hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的竞争性内源性RNA (ceRNA)。

Li LJ等[18]通过人类circRNA芯片检测了SLE患者和健康对照者T细胞中的circRNA表达谱，并在SLE患者中鉴定出127个差异表达的circRNA。通过定量PCR验证hsa_circ_0045272在SLE 患者T细胞中下调。使用特定的慢病毒短发夹RNA生成hsa_circ_0045272敲除稳定的Jurkat细胞，用于功能研究。流式细胞术分析显示，hsa_circ_0045272基因表达下调显著上调了Jurkat细胞的早期凋亡。同时，ELISA检测结果显示hsa_circ_0045272基因沉默显著提高了活化Jurkat细胞产生白细胞介素2。然后，对hsa_circ_0045272进行了ceRNAs的预测，并验证了两个预测为ceRNAs的mRNAs的显著下调，即NM_003466(PAX8)和NM_015177(DTX4)，但未验证其对应蛋白。此外，双荧光素酶报告基因检测显示hsa_circ_0045272与hsa_miR-6127结合。hsa_circ_0045272等异常circRNA在SLE中的意义值得进一步研究。

5 circRNA在SLE患者肾组织中的表达

Luan JJ等[19]研究提示在狼疮肾炎(LN)患者中，miR-150与肾脏慢性指数呈正相关。采用6例未接受治疗的女性Ⅳ型LN患者的肾组织和5例泌尿外科患者的正常肾组织进行circRNA测序。与正常对照组相比，LN组中鉴定出171个有2倍差异表达的circRNA。10个选定的circRNA通过real-time qPCR进行验证，其中7个circRNAs与测序结果一样显著增加。circHLA-C与蛋白尿、肾病理活动性指数、新月体肾小球数量呈正相关。LN组的肾脏circHLA-C较正常对照组升高2.72倍，miR-150下降66% 。生物信息学分析预测miR-150受到circHLA-C的调控，显示出circHLA-C和miR-150完全匹配的位点，LN患者肾脏miR-150与circHLA-C呈负相关趋势。提示circHLA-C可能通过浸润miR-150在LN发病机制中发挥重要作用。

崔思婉[20]的研究提示，通过高通量测序，在LN肾组织中筛选到159个差异表达的circRNA，包括73个表达上调和86个表达下调的circRNA。其中hsa_circ_0007379、NR4A1 mRNA显著下调，而miR-7977显著上调。通过KEGG Pathway分析发现hsa_circ_0007379/miR-7977/NR4A1调控网络可能在与LN相关的PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway途径上发挥作用。推测低表达的hsa_circ_0007379减弱与miR-7977的竞争性结合，下调NR4A1的表达，通过 PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway途径影响LN的发病。通过qRT-PCR验证hsa_circ_0007379、miR-7977、NR4A1 mRNA在结果显示在肾组织中，与对照组相比hsa_circ_0007379表达水平下调、 NR4A1 mRNA表达水平下调、miR-7977表达水平上调；在全血中，与对照组相比NR4A1 mRNA表达水平下调、miR-7977表达水平上调，与肾组织中验证的结果一致。hsa_circ_0007379、miR-7977、NR4A1 mRNA的表达水平与24 h尿总蛋白量、血肌酐、肾小球滤过率、AI、CI、SLEDAI评分、ESR无明显相关性。NR4A1 mRNA的表达水平与血白细胞、C3呈正相关。

Tian SY等[21]研究应用环状RNA (circRNA)芯片检测两组同年龄NZB/W F1雌性重症和轻度LN小鼠的肾小球中表达差异的circRNA，并通RT-qPCR检测证实。研究提示在重度LN中获得116个差异表达的circRNAs，其中41个上调，75个下调，其中12个经RT-qPCR证实。重度和轻度肾小球LN小鼠的mmu_circRNA_34428表达差异最大。结果表明，mmu_circRNA_34428在LN的发生过程中起重要作用。

6 circRNA在SLE儿童患者中的表达

Li SP等[2]比较SLE患儿和健康儿童，发现有348个circRNA和1162个mRNA表达差异。通过使用基因co-expression网络分析发现307对匹配的circRNA-mRNA中有124对存在差异表达(74个circRNA上调，50个circRNA下调)和142个差异表达mRNA(83个 mRNA上调，59个 mRNA表达下调)。内源性RNA(ceRNA)竞争网络包括42个差异表达的circRNA、41个差异表达的mRNA和71个预测miRNA。SLE患儿中hsa_circ_0021372和hsa_circ_0075699的水平与SLE患儿中C3和C4水平相关。hsa_circ_0057762水平与SLEDAI-2k评分呈正相关。circRNAs的ROC曲线显示，hsa_circ_0057762水平和hsa_circ_0003090水平可以区分SLE患者与健康对照人群。

7 circRNA在SLE患者全血中的表达

罗清等[22]研究表明，在对比SLE与健康对照组和其他自身免疫疾病患者中，结果发现SLE患者全血环状 RNA hsa_circ_0002715 表达水平均高于健康对照者和非SLE患者，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与补体3、补体4、白细胞数量、血红蛋白、血小板数量呈负相关，与抗双链 DNA抗体呈正相关，抗核小体阳性的SLE患者其全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平高于阴性者。SLE 患者和所有对照者(非SLE患者和健康对照者)全血环状RNA hsa_circ_0002715 AUC为0.701，敏感性为51.32%，特异性为80.17%。circRNA hsa _ circ _0002715对SLE的诊断敏感性高于 anti-dsDNA，且联合环状RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA对SLE的诊断效能升高。SLE患者全血circRNA hsa_circ_0002715的表达明显上调，且与SLE患者的疾病活动性和血液系统受累严重程度密切相关，联合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA可作为SLE的潜在诊断及鉴别诊断标志物。

8 小结

在SLE患者血浆、PBMCs或肾脏等组织中的circRNA表达异常，另外在儿童SLE患者中表达也存在异常，而且某些circRNA与SLE临床指标相关。因此随着研究的不断深入，相信SLE患者体内circRNA测定将有可能成为早期诊断及评估狼疮的病情进展及预后的一个新手段，同时为研究新的靶向治疗药物提供依据。但是SLE患者体液如尿液、腹水或胸水等是否有合适的诊断相关的circRNA，尚需要进一步研究，且当前已有的成果仍需深入研究，早日应用于临床，为SLE的诊断及治疗提供帮助。