多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1、凋亡诱导因子在卵巢癌组织中的表达及其临床病理意义

秦翱翔 沈 力

湖北省荆州市松滋市中医院肿瘤科，湖北荆州 434200

卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，因其隐匿性，确诊时多为晚期，患者5年存活率较低，其已成为严重威胁妇女生命的恶性疾病[1-2]。因此，积极寻找能够有效预测患者预后的分子标记物具有重要的意义。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly adenosine diphosphate ribose polymerase 1，PARP1）是DNA 损伤修复的关键酶，主要存在于细胞核，少量存在于细胞质中，在肿瘤的发生发展中起重要作用。过度的DNA 损伤及PARP1 表达，会造成细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）耗竭，进而使得凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor，AIF）及核酸内切酶G 从线粒体中释放，进入细胞核，诱发非caspase3 途径，最终导致细胞凋亡的发生[3-4]。细胞凋亡对于维持生物体正常发育起重要的作用，一旦凋亡调控机制发生紊乱，细胞恶变的潜能增高，最终可能转化为肿瘤。AIF 是新发现的一种凋亡效应分子，既具有细胞凋亡活性又具有氧化还原酶活性，可以不依赖于caspase 途径而行使细胞凋亡功能，在肿瘤细胞中呈现高表达，对细胞凋亡起促进作用[5-6]。目前，关于PARP1、AIF 在卵巢癌的研究未有报道，故本研究运用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中PARP1、AIF 表达情况，并分析其与卵巢癌患者各项病理参数及预后的关系，以期为卵巢癌诊疗及预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年6月至2017年6月于湖北省荆州市松滋市中医院手术切除且经病理证实的70 例卵巢癌组织标本及相应癌旁组织标本（距癌组织＞5 cm，经HE 染色显示无癌细胞浸润），所有癌组织标本均经病理证实为卵巢癌。患者平均年龄（56.63±7.42）岁，＜60 岁28 例，≥60 岁42 例；临床分期：Ⅰ期17 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期13 例；肿瘤直径：≤5 cm 27例，＞5 cm 43 例；组织学类型：浆液性37 例，其他33 例；分化程度：高分化14 例，中分化15 例，低分化41 例；有淋巴结转移43 例，无淋巴结转移27 例。

纳入标准： ①患者在术前均未经放化疗或其他治疗，且无手术禁忌；②患者经病理诊断证实为卵巢癌[7]；③患者及其家属对本研究知情同意，并签订协议书。排除标准：①患有肝病、高血压、心脏病等疾病者；②资料不完整，无法进行术后随访者。另收集患者肿瘤直径、组织学类型、临床分期、分化程度及有无淋巴结转移等临床病理资料。本研究经湖北省荆州市松滋市中医院道德伦理委员会批准通过，符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂

SP 免疫组化试剂盒及DAB 显色试剂盒，购自武汉博士德公司；山羊抗人AIF 多克隆抗体，购自Santa Cruz 公司；兔抗人PARP1 多克隆抗体，购自美国CST公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法检测组织标本中PARP1、AIF蛋白表达 采用免疫组织化学法检测各组织标本中PARP1、AIF 蛋白表达，具体操作如下。

①各组织标本经固定、石蜡包埋后，石蜡切片机切片，厚度约4 μm。②展片，60℃烘烤1 h。③常规二甲苯脱蜡，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇水化。④枸橼酸钠缓冲液煮沸18 min 进行抗原热修复。⑤滴加3%过氧化氢于室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。⑥磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）冲洗3 min×3 次，滴加1%牛血清白蛋白，孵育30 min 封闭非特异性结合位点。⑦而后吸弃封闭液（阴性对照除外），分别滴加山羊抗人AIF 多克隆抗体、兔抗人PARP1 多克隆抗体，置于4℃冰箱过夜。⑧取出切片，PBS 冲洗5 min×3 次，加入生物素标记的二抗，室温孵育40 min。⑨PBS 冲洗切片5 min×3次，DAB 显色，10%苏木精复染。⑩70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察染色情况并拍照。

1.3.2 结果判定 由三名病理医生对每张染色片进行评分取均值，以细胞浆或细胞膜呈棕黄色颗粒为阳性显色。根据染色强度和阳性细胞百分比来进行评分。

①细胞染色强度评分标准：0 分（无染色），1 分（浅黄色），2 分（棕黄色），3 分（棕褐色）。②阳性细胞百分比评分标准： 阳性细胞数＜10%，记0 分；10%～25%，记1 分；26%～50%，记2 分；51%～80%，记3 分；＞80%，记4 分。染色指数（staining index，SI），即染色强度与阳性细胞百分比评分乘积。SI＜3 分，阴性（-）；SI=3 分，弱阳性（+）；3 分＜SI＜6 分，中等阳性（++）；SI≥6 分，强阳性（+++）。其中阴性和弱阳性表示低表达，中等阳性和强阳性表示高表达。

1.3.3 随访 所有患者均有完整的随访资料，随访时间36 个月，死亡患者以死亡时间作为随访截止日期，无病生存期（disease-free survival，DFS）的计算为从手术日期至疾病复发或因疾病进展导致患者死亡的时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t 检验；计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验；采用Spearman 分析卵巢癌组织中PARP1 与AIF 表达相关性采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，行Log-rank 检验； 采用Cox比例风险模型分析影响卵巢癌患者预后的危险因素，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织和癌旁组织中PARP1、AIF 表达情况的比较

卵巢癌组织中PARP1、AIF 阳性表达率分别为72.86%（51/70）和70.00%（49/70），均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌组织和癌旁组织中PARP1、AIF 表达情况的比较[n（%）]

2.2 卵巢癌组织中PARP1、AIF 表达与患者临床病理指标的关系

PARP1、AIF 在卵巢癌组织中的表达与患者年龄、肿瘤直径、组织学类型无相关性（P＞0.05）。PARP1、AIF 高表达患者临床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴结转移比例均高于低表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 卵巢癌组织中PARP1、AIF 表达与患者临床病理指标的关系[n（%）]

2.3 卵巢癌组织中PARP1 与AIF 表达的相关性

卵巢癌组织中PARP1 与AIF 表达呈正相关（r=0.791，P＜0.05）（表3）。

表3 卵巢癌组织中PARP1 与AIF 表达的相关性（n）

2.4 卵巢癌组织中PARP1、AIF 表达与患者术后DFS 的关系

PARP1 高表达卵巢癌患者中位DFS 为6.78 个月，短于PARP1 低表达患者的23.32 个月，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。AIF 高表达卵巢癌患者中位DFS 为7.80 个月，短于AIF 低表达患者的28.00 个月，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图1 卵巢癌组织中PARP1 表达与患者术后DFS 的关系

图2 卵巢癌组织中AIF 表达与患者术后DFS 的关系

2.5 影响卵巢癌患者预后的危险因素

单因素分析显示，PARP1、AIF、临床分期、分化程度及有无淋巴结转移均是影响卵巢癌患者预后的危险因素（P＜0.05）。多因素Cox 分析显示，临床分期、分化程度、有无淋巴结转移、PARP1 及AIF 均是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）（表4）。

表4 影响卵巢癌患者预后的危险因素

3 讨论

手术切除病灶是目前卵巢癌的主要治疗手段，辅以放化疗或放疗，但治疗效果有限[8-9]。因此寻找具有诊断、 预后预测潜力的标志物及新治疗靶点成为现阶段的研究热点。PARP1 是具有多聚二磷腺苷酸核糖基催化活性的蛋白酶，存在于多数真核细胞内，在DNA 损伤修复、细胞周期、基因组稳定和细胞死亡等方面均发挥重要作用[10-12]。PARP1 在卵巢癌中的呈现高表达，能促进卵巢癌的生长及淋巴结转移[13-14]。本研究结果显示，卵巢癌组织中PARP1 阳性表达率高于癌旁组织，PARP1 高表达患者临床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化及有淋巴结转移比例均高于低表达患者（P＜0.05），与张灿灿等[14]研究相似，提示PARP1 在卵巢癌组织中存在异常高表达，可能参与卵巢癌的发生及发展。

细胞凋亡是一系列酶参与的生化反应，在维持正常细胞更新和异常细胞清除平衡中起着重要作用，受许多凋亡相关因子的影响[6，15]。AIF 是具有促凋亡活性的蛋白，又具有氧化还原酶活性，在肿瘤细胞中呈现高表达，对细胞凋亡起促进作用[5，16]。陈吉等[17]研究报道，胃黏膜组织中AIF mRNA 高表达与胃癌形成有一定关联，可作为早期评估胃癌的临床指标。本研究结果显示，卵巢癌组织中AIF 阳性表达率高于癌旁组织，AIF 高表达患者临床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴结转移比例均高于低表达患者（P＜0.05），与陈吉等[17]研究结果相似，提示AIF 能够为肿瘤细胞生长活动提供能量，促进肿瘤细胞增殖、生长，提示AIF 在卵巢癌发生发展中发挥一定作用。

DFS 是在根治性手术后作为辅助化疗时最常用的终点指标，本研究Kapalan-Meier 生存曲线分析结果显示，PARP1 和AIF 高表达卵巢癌患者中位DFS均短于低表达患者（P＜0.05），表明PARP1 和AIF 可能作为卵巢癌的预后指标，其高表达提示患者预后较差。进一步采用Cox 模型分析结果显示，临床分期、分化程度、有无淋巴结转移、PARP1 及AIF 均是影响卵巢癌患者预后的危险因素（P＜0.05），而PARP1、AIF、临床分期及分化程度是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），提示PARP1 和AIF 可能作为判断卵巢癌患者预后的参照指标。同时需关注卵巢癌的临床分期、分化程度对患者预后的影响。此外，本研究结果显示卵巢癌组织中PARP1 与AIF 表达呈正相关（P＜0.05），由此也提示PARP1、AIF 在卵巢癌发生发展中可能协同发挥作用进而影响肿瘤细胞生物学过程，但具体机制尚需深入探究[15-16]。

综上所述，PARP1、AIF 在卵巢癌组织中阳性表达率高于癌旁组织，其与卵巢癌患者临床分期、分化程度、有无淋巴结转移及DFS 相关，可能作为评定卵巢癌患者预后的临床参考指标。但由于目前研究的局限性，PARP1、AIF 参与卵巢癌发生发展的具体作用机制有待进一步研究。