肺癌患者术后血液高凝状态与外周血循环肿瘤细胞的相关性分析

王晓康 袁锦权

广东省东莞市松山湖中心医院胸心外科，广东东莞 523000

近几十年来，随着人们生活方式的改变、环境污染和吸烟人数的增加，肺癌患者的发病率和死亡率逐年增高[1-2]。肺癌患者在患病期间以及手术前后往往伴随一系列的并发症，其中静脉血栓栓塞在肺癌活动期的发生风险越来越受到研究者的关注[3-5]。研究表明，血液的高凝状态是静脉血栓形成的直接因素，出现静脉血栓的患者生存期明显缩短，同时血液的高凝状态促进肿瘤的发展和转移[6]。而外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）是肿瘤转移的必要前提条件，目前有关血液高凝状态与外周血CTC 之间的关系研究较少，因此本研究通过对120 例经肺癌切除术的患者临床资料进行回顾性分析，以分析血液高凝状态与外周血CTC 之间的关系及其对肺癌患者术后恢复的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取2015年2月至2017年5月松山湖中心医院胸外科收治的120 例肺癌患者为研究对象，根据外周血CTC 的检测结果分为CTC 阳性组（42 例）和CTC 阴性组（78 例）。纳入标准：①经医院病理学检验确诊为原发性肺癌；②接受肺癌根治术治疗；③卡氏评分≥60 分[7]；④未接受过其他抗肿瘤治疗。排除标准：①不能接受肺癌切除手术治疗；②合并患有其他部位肿瘤；③合并患有静脉栓塞疾病；④合并患有其他肺部疾病的患者；⑤手术前使用过抗凝或止血类药物；⑥严重肝、肾功能不足者。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

于手术后48 h 采集患者空腹状态下的静脉血，分别采用全自动血凝分析仪（贝克曼ACL7000）和血细胞分析仪（贝克曼LH750）对患者外周血中的D-二聚体（D-dimer，D-D）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）因子和血小板（platelet，PLT）水平，同时检测外周血CTC。实验操作如下： 取无菌的PBS 缓冲液5 ml 与采集的血液充分混匀，加入等体积的Ficoll 分离液，1500 r/min离心20 min，离心完毕小心吸取中间乳白色的单核细胞层，转移至新的15 ml 离心管中，加入5 倍体积的PBS 缓冲液与细胞充分混匀，室温下以转速2000 r/min离心15 min，离心结束后弃掉上清，然后加入10 ml无菌PBS 缓冲液将细胞重悬，同样转速离心10 min。弃掉上清，用100 μl 磁珠缓冲液将细胞重悬，加入15 μl CD45 抗体溶液，轻吹混匀后，于4℃静置孵育20 min。孵育的过程中取出免疫磁珠，用磁珠缓冲液清洗一遍，然后用2 ml 磁珠缓冲液重悬备用。抗体孵育完毕后，加入10 ml 磁珠缓冲液，室温下2000 r/min离心5 min，舍弃上清液。用准备好的磁珠缓冲液将细胞重悬，用混匀仪室温充分混匀15 min。混匀后用移液枪将细胞转移至美天旎磁珠分选柱，常压过柱子，待液体流动完毕加入500 μl 缓冲液冲洗2 次，合并收集流穿液。将收集的细胞悬液于2000 r/min 离心10 min，弃上清，轻弹细胞团至散开，然后将其取出均匀的涂抹在载玻片上，采用4%多聚甲醛在室温下将细胞固定10 min，用PBS 洗涤三次，加入抗广谱角蛋白抗体于2～8℃孵育30 min，然后用PBS 洗涤一次，加入二抗孵育30 min。最后采用HE 染色5 min，风化脱水至透明状态，以中性树胶封片，方法参考文献[20]。

1.3 观察指标及评价标准

外周血D-D 的正常范围为0～0.55 mg/L，FIB 正常范围为1.8～3.5 g/L，PLT 正常范围为（125～350）×109/L。CTC 阳性判断标准：通过显微镜观察细胞呈圆形或椭圆形，可见完整细胞膜和清晰的细胞形态，细胞平均直径大于10 μm；细胞质染色阳性，呈蓝黑色或褐色；核质比异常[19]。

收集并对比所有患者的临床资料，依据外周血CTC 的检测结果将患者分为CTC 阳性组和CTC 阴性组。同时分析所有患者的临床资料以及D-D、FIB和PLT 等凝血指标进行分析对比。在手术结束后至2020年5月，定期对患者进行电话或门诊随访，患者死亡则终止随访，根据死亡和存活情况将患者分组，并分析术后预后的危险影响因素。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；单因素分析采用χ2检验，单因素分析中，差异有统计学意义的变量，纳入多因素logistic 回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料的比较

CTC 阳性组术后肿瘤转移、淋巴结转移的发生率及TMN 分期为Ⅲ期的占比高于CTC 阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组患者临床资料的比较[n（%）]

2.2 两组患者凝血指标的比较

CTC 阳性组患者的外周血中D-D、FIB 及PLT 水平均高于CTC 阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组患者凝血指标的比较（±s）

表2 两组患者凝血指标的比较（±s）

组别 D-D（mg/ml） FIB（g/L） PLT（×109/L）CTC 阳性组（n=42）CTC 阴性组（n=78）t 值P 值3.42±0.54 0.75±0.66 16.710＜0.001 4.01±0.98 0.98±1.02 13.452＜0.001 366.75±35.63 231.41±52.13 9.665＜0.001

2.3 肺癌患者术后预后的影响因素分析

从随访开始到随访结束，所有患者的平均随访时间为（31.35±2.95）个月，其中5 例患者脱落，115 例患者中，死亡35 例，3年的存活率为69.57%（80/115）。单因素分析显示，死亡组患者TMN 分期为Ⅲ期、CTC为阳性的患者比例均高于存活组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。由于性别、年龄、吸烟史、TMN 分期、病理分型、CTC、手术切除方式都可能影响预后，为了明确是否有混杂因素，故均纳入多因素分析，结果显示，TMN 分期及CTC 是患者死亡的独立影响因素（P＜0.05）（表4）。

表3 影响肺癌患者术后预后的单因素分析[n（%）]

表4 影响肺癌患者术后预后的多因素分析

3 讨论

血液高凝是由多种疾病原因引起的血液中促凝血因子增加、抗凝血因子水平下降的一种状态，患者往往会出现纤溶功能受损、静脉瘀血、高脂血症、低蛋白血症和血液黏滞度增加等临床症状，而且激素和利尿剂的使用都会引起血浆FIB 水平及其降解产物的增高，从而产生血液高凝状态[8-9]。最初这种现象是在肾病综合征病人体内发现，血液高凝的发生和发展贯穿在许多慢性疾病中比如心脑血管疾病、 糖尿病、高血脂和血栓性疾病中，后来的临床观察发现肿瘤患者术后同样容易发生血液的高凝状态，而且这种状态会对肿瘤患者术后的预后产生极大的影响[10-12]。

临床研究发现，90%以上发生肿瘤恶性转移的患者体内都存在血液高凝状态，包括急性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌等[13]。其中肺癌是最常见的恶性肿瘤，也是最容易转移的肿瘤，其致死率在所有癌症中居首位[14]。肿瘤利用多重手段打破了机体的凝血和抗凝系统的平衡，手术切除、放疗和化疗等一些治疗手段会加重这种失衡的状态，从而使机体血液处于高凝状态，而这种高凝状态对于肿瘤的恶化具有促进作用，并且能够促进肿瘤的发展和转移[15]。因此，临床医生越来越关注肿瘤患者血液高凝状态的机制研究，并在发生早期采取一定的干预手段，这对于肿瘤患者的治疗、术后良好的预后和生存期的提高具有积极的指导意义[16]。

血液高凝状态是静脉血栓发生发展的初期阶段，在这个过程中，D-D、FIB 和PLT 等因子发挥着重要的作用，临床上常作为血栓形成和高凝状态诊断的指标[17]。D-D 是血液中FIB 经过纤溶酶活化和分解后的降解产物，其水平升高说明机体的FIB 溶解过度并存在高凝状态，因此血液中D-D 的水平对于血栓性疾病的诊断和疗效评估具有一定的指导意义[18]。FIB 是血液中含量最丰富的凝血因子，其在凝血过程中在凝血酶作用下降解为单体蛋白质而发挥凝血功能，其在感染过程和肿瘤患者体内水平明显升高，是血栓发生的危险因素[19]；PLT 是参与凝血的重要组分之一，在肿瘤患者体内，PLT 被肿瘤细胞分泌的凝血活性因子黏附聚集在肿瘤表面，同促进肿瘤细胞的快速转移和发展[20-21]。

本研究发现，CTC 阳性组患者在术后发生肿瘤转移和淋巴结转移的比例高于CTC 阴性组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），同时CTC 阳性组患者中TMN分期为Ⅲ期的比例高于CTC 阴性组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示CTC 的存在促进了肿瘤细胞的转移和恶性发展。对患者外周血检测发现，CTC 阳性组患者的外周血中D-D、FIB 和PLT 的水平均高于CTC 阴性组的患者，差异有统计学意义（P＜0.05），表明外周血中CTC 的存在与肿瘤患者的血液高凝状态具有一定相关性。CTC 的存在是肿瘤发生转移的早期现象，同时肿瘤细胞通过分泌一些促凝因子激活外周血中的凝血酶原，促进凝血，从而提高了肿瘤细胞在组织靶器官的黏附，促进其转移灶的发生和发展。

综上所述，CTC 阳性的肺癌患者在根治术后容易发生血液高凝状态，并伴随着肿瘤的术后转移，可对肺癌患者的临床诊断和病情评估提供参考依据，对患者的术后预后具有一定的预测价值。