HBV对HOXA10表达的影响及其机制研究

宋 惠， 杨 兰， 徐莉敏， 沈振华， 刘倩倩， 刘兴晖

（上海市浦东新区公利医院检验科，上海 200135）

有研究结果显示，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发病率比普通人群高出200倍，我国HCC患者中80%有HBV感染史[1]。HBV感染引起HCC的机制目前尚不明确。同源框蛋白A10（homeobox protein A10，HOXA10）属于人类的同源框（homeobox，HOX）基因，是DNA结合转录因子，拥有序列特异的DNA结合活性，参与生殖道发育、胚胎植入的调控及细胞定向分化和增殖，在胚胎发育、分化、癌症和造血系统疾病中发挥重要作用[2]。目前，HOXA10在HBV感染中的作用鲜有报道。ZHU等[3]采用基因芯片筛选到HOXA10在整合了HBV全基因组的HepG2.2.15细胞株中呈高表达。为此，本研究拟探讨HBV对HOXA10表达的影响及其调节的分子机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取上海市浦东新区公利医院临床确诊为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的患者20例（CHB组），其中男12例、女8例，年龄（43.5±14.9）岁，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2019年版）[4]。所有患者均排除丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒等其他病毒感染。选取上海市浦东新区公利医院体检中心既往无病史、无肝炎病毒感染史且体检报告无任何异常的健康体检者23名，其中男14名、女9名，年龄（42.7±15.6）岁。本研究经上海市浦东新区公利医院伦理委员会批准，所有对象均签订知情同意书。

1.2 材料

人肝癌细胞系HepG2及HepG2.2.15均购自武汉大学典藏培养物保藏中心。Lipofectamine 2000、TRIzol R、SYBR GreenER qPCR mix和逆转录酶M-MLV均购自美国Invitrogen公司。兔抗人HOXA10单克隆抗体及羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司。HBV单个基因（S基因、E基因、C基因、X基因和P基因）的真核表达质粒pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P及含有HOXA10基因启动子的荧光素酶报告基因pGL3-HOXA10由本实验室自行构建[4]。

1.3 细胞培养

将HepG2细胞和稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱进行培养。

1.4 细胞转染

当细胞密度达到60%～70%时，用100 μL Opti-MEM减血清培养基分别稀释pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P、空载体pCMV-tag2B、pGL3-HOXA10和Lipofectamine 2000，稀释比例均为1∶2，室温放置5～10 min后混匀，继续静置5～10 min，将配好的Lipofectamine 2000和质粒悬液加入细胞培养板中培养，4～6 h后更换新鲜培养液继续培养。

1.5 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分离

在15 mL离心管中加入3 mL淋巴细胞分离液（景德镇市美景生物科技有限公司），取1 mL抗凝血样本，加入等体积磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）稀释后混匀，缓慢加至淋巴细胞分离液的液面上，117×g离心20 min，小心环吸乳白色单个核细胞层。

1.6 RT-qPCR

将X基因真核表达质粒p C M V-X和空载体pCMV-tag2B分别转染HepG2细胞，采用TRIzol R试剂提取细胞总RNA，采用逆转录酶M-MLV将RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）及SYBR GreenER qPCR mix试剂盒[实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）]检测HOXA10基因，引物序列：HOXA10上游引物为5'-CTCTACGACTCGGCGGACAA-3'，下游引物为5'-GGCCTGAGAAAGGCGGAAGT-3'，以HOXA10 mRNA/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA比值作为HOXA10 mRNA的相对表达量。

1.7 免疫印迹法检测HOXA10蛋白的表达

配制用于十二烷基硫酸钠（s o d i u m dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）的浓缩胶（含5%丙烯酰胺）及分离胶（含10%浓缩胶）。提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定总蛋白浓度，每份样本的上样量约为 40 μg，加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min。70 V恒压电泳，待样本电泳进入分离胶后，改为100 V恒压电泳，180 mA转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，磷酸盐吐温缓冲液（phosphate-buffered saline Tween-20，PBST）清洗，加入一抗，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育1 h，再次用PBST洗膜，将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于ECL显色液中，孵育5 min，用ImageQuant LAS 4000化学发光成像分析仪（美国GE公司）收集显色信号，保存图片。以HOXA10/GAPDH比值作为HOXA10蛋白的相对表达量。

1.8 荧光素酶活性测定

将pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P分别与pGL3-HOXA10用Lipofectin2000共转染HepG2细胞，以转染空载体pCMV-tag2B的HepG2细胞作为对照。转染48 h后加入RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司）进行裂解，取10 μL裂解液与100 μL荧光色素酶底物（广州赛诚公司）充分混匀，用Luminometer化学发光酶标仪（美国Maxweu Sensors公司）测定荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝癌细胞系及CHB组、正常对照组HOXA10 mRNA和蛋白的表达

HepG2.2.15细胞中HOXA10 mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于HepG2细胞（P=0.001）。见图1。

图1 不同肝癌细胞系HOXA10 mRNA和蛋白的表达

HBV患者PBMC中HOXA10 mRNA的相对表达量为1.37±0.21，显著高于正常对照组（0.28±0.03）（P=0.001）。

2.2 转染不同质粒的HepG2细胞之间荧光素酶活性比较

转染pCMV-tag2B、pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X和pCMV-P的HepG2细胞的荧光素酶活性分别为（269.33±27.24）、（295.12±25.53）、（255.42±26.33）、（289.23±23.65）、（1 235.65±62.21）和（302.33±38.31）RUL/μg蛋白。转染pCMV-X的HepG2细胞的荧光素酶活性显著高于转染空载体pCMV-tag2B的HepG2细胞（P=0.001），转染其他质粒的HepG2细胞之间荧光素酶活性差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.3 转染pCMV-X的HepG2细胞与转染空载体pCMV-tag2B的HepG2细胞之间HOXA10 mRNA和蛋白表达的比较

转染pCMV-X的HepG2细胞HOXA10 mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于转染空载体pCMV-tag2B的HepG2细胞（P=0.001）。见图2。

图2 转染pCMV-X的HepG2细胞与转染空载体pCMV-tag2B的HepG2细胞之间HOXA10 mRNA和蛋白相对表达量的比较

3 讨论

有研究结果显示，HOXA10基因高表达与白血病、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等肿瘤的发生、发展有关[6]。HOXA10启动子的甲基化水平与高表达HOXA10的脑胶质瘤和乳腺癌有关[7-8]。TANG等[8]的研究结果显示，miR-135a是HOXA10的靶点RNA，抑制HOXA10的过表达能够抑制卵巢癌细胞的生长和黏附；同时，敲除HOXA10后能够抑制细胞的凋亡。

HBV是肝癌的主要诱因之一，但其致病机制不明。为深入探讨HBV的致癌机制，本课题组前期采用基因芯片筛选了HepG2细胞与稳定表达HBV的Hep2.2.15细胞中表达有差异的基因[3]，发现稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞中HOXA10的表达高于HepG2细胞。本研究采用RT-qPCR和免疫印迹法对基因芯片的检测结果进行了验证。

HBV可以被吞噬进入PBMC，并刺激PBMC产生某些细胞因子，以回应病毒的感染。本研究结果显示，HBV患者PBMC中HOXA10表达升高。HBV属于嗜肝DNA病毒科，为部分双链环状DNA分子，其基因组含有4个开放读码框，分别为S、C、P和X；其中，X基因编码154个氨基酸残基的X蛋白，相对分子质量为17 000，与致癌作用密切相关[9-10]。YANG等[11]发现，HBV通过上调HOXA10的表达促进HBV的复制，但具体通过哪个基因调节HOXA10的表达尚不清楚。为深入探讨HBV调节HOXA10表达的分子机制，本研究检测了HBV各个基因的真核表达质粒（pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P）对HOXA10基因启动子活性的影响。结果显示，HBVX基因能够上调HOXA10的启动子活性，上调HOXA10 mRNA和蛋白的表达。由此可见，HBV可能是通过其X基因上调HOXA10的表达。

HBV X蛋白具有多种调节功能，包括调节转录修饰、信号转导、细胞周期和凋亡，在肝癌的发生、发展中起重要的作用，参与肝癌细胞的增殖和转化[12-14]。HBVX基因可以调节多种宿主蛋白的表达，参与肿瘤的发生、发展[15]。LI等[16]的研究结果显示，HBVX基因能够上调趋化因子CCL15的表达，且CCL15的表达水平与疾病预后相关。LIU等[5]的研究结果显示，HBV通过其X基因调节羧基末端结合蛋白2的表达来参与肝癌的形成。ZHANG等[17]发现，敲除HOXA10后可抑制肝癌细胞的增殖，并通过调节组蛋白脱乙酰基酶的转录来促进肝癌细胞的凋亡。

综上所述，HBV可能通过其X基因调节HOXA10的表达来参与肝癌的发生、发展。但HBVX基因调节HOXA10表达的具体分子机制还有待进一步研究。