健康人血液中人乳头瘤病毒DNA检测及定量分析

刘宏钱， 宋朝晖， 梁巧米

（浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006）

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宫颈癌的重要致病因子[1]。目前，已经发现的HPV亚型有200多种[2]，其中14种与生殖道癌高度相关，被称为高危型HPV[3]。全球范围内70%的宫颈癌是由HPV 16型和HPV 18型导致的[4]。另外，HPV感染也与口咽癌、生殖器疣和皮肤疣等密切相关；HPV可感染上皮细胞，其复制周期与宿主细胞分化密切相关[5-7]。高危型HPV感染宫颈上皮细胞时，病毒通过子宫内膜和外子宫颈之间的单层鳞状细胞到达目标上皮细胞[8]。多项对于有高度病变症状的患者的研究结果表明，HPV DNA广泛存在于生殖道感染患者、宫颈癌患者、口咽鳞状细胞癌患者、头颈部癌症患者和肛门鳞状细胞癌患者血液中[9-13]。此外，也有HPV DNA在人类免疫缺陷病毒感染的儿童外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中被检出的报道[14]。这些发现均提示，在癌症患者的血细胞中检测到的HPV可能来源于病变晚期的转移细胞，或PBMC释放。健康和无症状感染者PBMC中也能检测到HPV DNA。CHEN等[15]在8.3%的澳大利亚献血者的血液中检出HPV DNA，提示PBMC可能是HPV的一个储存库和一个潜在的新的传播途径。然而，这些初步结果并没有被新的研究证实。因此，对于HPV DNA在健康献血者PBMC中是否存在，仍需要更加广泛的研究。本研究旨在通过对献血人群的PBMC进行HPV DNA定量检测和评估，为血液作为HPV传播途径的可能性提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样本来源

采集2019年10—12月杭州市第一人民医院血液中心207名健康献血者的血液，献血者中男94名、女113名，年龄18～60岁。所有献血者人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和梅毒螺旋体血清学筛查结果均为阴性。

1.2 试剂与仪器

LightCycler480荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司），DNeasy Blood & Tissue Kit（德国Qiagen公司），10×SYBR Green qPCR buffer（美国伯乐公司），Taq酶、dNTPs[宝生物（大连）工程有限公司]。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA抽提

取1 mL全血放入含1 mL 0.9%氯化钠溶液的洁净玻璃管中，混匀，吸取混匀液，沿管壁缓慢加入到含0.5 mL Ficoll溶液的洁净玻璃管中。2 300×g离心20 min，吸取中间层白色细胞（单核个细胞）于1.5 mL离心管中，13 800×g离心5 min，弃上清液，提取沉淀中的DNA，严格按照试剂盒说明书要求进行操作。

1.4 HPV-DNA定量检测

采用LightCycler480荧光定量PCR仪进行HPV DNA定量检测，采用通用引物GP5+/GP6+扩增HPV L1基因约150 bp的片段，同时扩增内参基因β-globin上长度为268 bp的片段，内参基因扩增引物参照文献[16-18]进行设计。PCR体系为50 μL，包括10×SYBR Green qPCR 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2），1.5 U Taq DNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTPs，正、反向引物各0.06 μmol/L，2 μL DNA模板。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，循环40次；72 ℃延伸10 min。每个样本均同时做HPV和内参基因平行检测。

标准曲线用10倍梯度稀释的、携带完整HPV-16基因的SiHa细胞（分别包含1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101病毒拷贝）。病毒载量计算公式为：log（拷贝数）=-0.277 6×Ct+11.005；r2=0.997 3。该方法的灵敏度为1×101病毒拷贝。HPV病毒载量以每毫升血液中病毒拷贝数表示。

1.5 HPV-L1基因的扩增和测序

使用通用引物GP5+（5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3'）和GP6+（5'-GAAAATAAACTGTAAATCATTC-3'）扩增HPV-L1基因140～150 bp特异性片段。在反应体系为25 μL的Go-Taq Master mix（Promega）中进行。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸数据库进行Blast比对。

2 结果

2.1 献血者流行病学特征

207名健康献血者均未报告明显或无症状的HPV感染。有14名（6.8%）献血者HPV DNA定量检测阳性，其中男5名、女9名，年龄（38.7±12.4）岁。

2.2 HPV DNA检测及分型结果

用GP5+/GP6+引物从阳性样本HPV L1基因中扩增出140～150 bp的基因组区域，对扩增的特异性片段进行Sanger测序，测序结果与NCBI核酸数据库进行比对。结果显示，14例阳性样本中有7例为单一型别HPV感染，7例为混合感染。单一感染中有3例为16型，其余分别为33型、51型、70型和82型（各1例）。多重混合感染包括5例16型和18型双重感染，1例51型和59型混合感染，1例16型、32型、35型和66型4重感染。见表1。

表1 健康献血者HPV DNA阳性样本型别分布和病毒载量

2.3 HPV病毒载量检测结果

所有阳性样本病毒载量为12.4～39.3拷贝/mL，平均为（21.30±8.27）拷贝/mL。单一型别感染HPV病毒载量为16.8～39.3拷贝/mL；多重混合感染中HPV病毒载量为7.8～24.6拷贝/mL。见表1。

3 讨论

众所周知，上皮细胞是HPV感染的靶细胞，病毒复制与细胞分化紧密相关。此外，有研究发现，宫颈癌患者血液细胞中也存在HPV DNA[19]。PAO等[20-21]首次在52%（13/25）的泌尿生殖道感染妇女的血液样本中检测到多种型别的HPV DNA，在宫颈癌患者的血液中也能检测到HPV DNA。在宫颈癌前病变、头颈部鳞状细胞癌和口咽癌患者的血清或血浆中都检测到HPV DNA[22]。这些患者血液中的HPV DNA可能来源于转移性的感染细胞，或者是HPV感染细胞存在于血液中，即HPV感染的细胞会从局部感染部位进入患者血液。

有学者发现，14%（8/57）的人类免疫缺陷病毒阳性的婴幼儿HPV-16 DNA阳性[14]。这些患儿HPV DNA阳性不能用HPV感染的肿瘤细胞的存在来解释。在这种情况下，HPV DNA大概率是通过输血传播或者母婴传播，提示HPV可通过血液传播。

目前，仅有2项研究报告了健康人外周血中存在HPV DNA[14-15]。BODAGHI等[14]检测了19名健康献血者，其中HPV-16 DNA阳性3名，阳性率为15.8%；他们推测HPV DNA是以游离DNA的形式存在于这些献血者血液中的。但他们研究中纳入的样本数偏少，相关结论尚需更多样本和研究来证实。澳大利亚的1项研究结果显示，有8.3%（15/180）的健康献血者外周血白细胞中存在HPV DNA，其中高危型占1.7%（3/180）[15]。本研究在健康献血者的PBMC中检出了6.8%（14/207）的HPV DNA阳性，其中高危型占92.9%（13/14），远高于澳大利亚的研究数据[15]。高危型所占比例的差异可能源于不同国家、不同地区HPV型别的流行性差异。

目前，关于宫颈癌患者血液中HPV病毒载量的研究比较少，有研究报道的平均值为586拷贝/mL[23]，也有研究报道的平均值为253拷贝/mL[24]，DONG等[25]在血浆样本中检测到的平均值为183拷贝/mL。提示HPV病毒载量作为一个潜在指标，可应用于监测宫颈病变进程和宫颈癌转移、复发等。

本研究主要对健康献血者血液样本中的HPV载量进行了定量分析，之前针对献血者血液中HPV的研究主要是定性的，未对HPV DNA进行定量分析。本研究结果显示，献血者HPV DNA阳性样本的病毒载量比较低，为12.4～39.3拷贝/mL，平均为（21.3±8.27）拷贝/mL。血液中低病毒载量在临床上的意义目前尚不清楚，不排除部分健康献血者存在潜在的生殖道或者其他部位的HPV感染，亦或存在HPV感染史，还需要进一步研究。