环状RNAs对糖尿病微血管并发症作用的研究进展

龚芸 周嘉强

糖尿病微血管病变作为糖尿病最常见的并发症，严重威胁人类的生命健康，是导致糖尿病患者致死、致残的重要原因之一[1]。研究表明内皮受损、氧化应激、代谢异常等多因素参与了糖尿病微血管病变病理机制。然而，其明确的发病机制至今仍未完全阐明[2]。因此，对于糖尿病微血管并发症的研究一直是糖尿病领域关注的热点与难点。近年来研究证实，在糖尿病患者和健康受试者外周血中能够检测到环状RNAs（circular RNAs,circRNAs）存在显著性差异表达，并且circRNAs可调节胰岛β细胞功能，影响机体胰岛素分泌，说明circRNAs对糖尿病的发生、发展起着重要的调控作用[3]。circRNAs是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，以共价结合所形成闭合环状结构的一类内源性的非编码RNA分子，在物种间高度保守，具有稳定性、多样性及一定的疾病特异性，可通过转录、转录后及翻译等水平调控基因的表达，广泛参与机体的病理生理过程[4-5]。本文旨在通过介绍circRNAs的结构特点、生物学特性，对circRNAs与糖尿病微血管并发症发生、发展的关系作一综述。

1 环状RNA概述及其生物学功能

20世纪70年代，科学家首先在RNA病毒中发现了circRNAs，但由于其表达水平较低，当时被认为是由于可变剪切出错形成的，甚至被认为是实验操作因素或是遗传异常造成的，没有引起学术界的重视[6]。然而，随着RNA测序技术的跨越式发展以及生物信息学手段不断成熟，在人类、小鼠、线虫和植物等多细胞生物中发现成千上万种circRNAs[7]。circRNAs的形成方式主要有以下2种：（1）通过内含子的反义互补序列配对，使3′端剪切供体邻近5′端剪切受体，从而攻击受体，形成环状结构。（2）外显子反剪接和跳跃剪切后，剪切片段形成内部套索结构，诱导其成环[8]。

尽管circRNAs的表达普遍较低，并且不是真核转录组中的主要成员，但是由于其特殊的拓扑结构使得circRNAs在某些特殊的时空中发挥了重要作用，其可通过调控转录、微小RNA（miRNA）分子海绵功能、干扰可变剪切、结合RNA结合蛋白等方式发挥丰富的生物学功能[9]。目前在动物研究中所涉及的功能如下：（1）调控转录及剪切过程：由于绝大多数的circRNAs来源于编码基因的外显子，这些过程能够通过竞争外显子来影响mRNA前体的剪切过程，从而进一步改变基因表达。（2）circRNAs作为内源性mRNA的竞争者，是miRNA的海绵吸附体：研究表明circRNAs有很多miRNA的结合位点，可作为miRNA的海绵吸附体，抑制miRNA的翻译功能。（3）编码蛋白质：由于缺乏帽子和poly（A）尾巴，circRNAs并不能依赖经典的m7G帽子结构途径进行翻译。近几年的研究表明，一小部分circRNAs具有编码潜能，当内部核糖体进入位点（internal ribo some entry sites，IRESs）元件插入到起始密码子AUG的上游时，能够启动翻译。除了IRES途径，N6-甲基腺苷（m6A）修饰能够直接影响circRNAs翻译过程。虽然不依赖帽子的翻译方式效率较低，但circRNAs编码过程一般都发生在逆境条件下，可能作为实现某些功能的补充。（4）与RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用：circRNAs能够与不同的蛋白质相互作用形成特定的circRNA-蛋白质复合物，改变相关蛋白质的构象从而调控彼此的功能[10-12]。

2 circRNAs参与糖尿病微血管并发症的发生、发展

随着糖尿病病程加重，患者会出现多种血管并发症，如何有效地阻遏糖尿病患者血管并发症的发生与发展，是糖尿病研究学界亟待解决的难题。糖尿病血管病变主要包括大血管病变和微血管病变，大血管病变主要累及主动脉、冠状动脉等大血管，以动脉粥样硬化为主要特征；微血管病变是糖尿病特有的慢性血管并发症，主要表现为视网膜病变、神经系统病变、肾脏病变等。在糖尿病微血管并发症中，circRNAs发挥了举足轻重的作用[13]。

2.1 circRNAs与糖尿病肾病糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的微血管并发症，是导致终末期肾病的主要原因。研究发现，高血糖状态下系膜细胞增殖、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积累、氧化应激和炎症的异常调节是DN发生、发展的重要因素。Hu等[14]通过circ RNAs表达谱芯片分析发现circRNA_15698在db/db DN小鼠和暴露于高糖（25 mM）的小鼠系膜细胞（SV40-MES13）的表达水平较对照组明显升高。机制研究发现circRNA_15698可作为miR-185的“分子海绵”，调控转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）蛋白的表达，促进了ECM相关蛋白的合成，从而促进DN的进展。circHIPK3在DN小鼠组织和大鼠系膜细胞中的表达上调；下调circHIPK3表达能够抑制系膜细胞增殖，并显著降低周期蛋白D1、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、TGF-β1、Ⅰ型胶原（collage I，COL-I）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的表达；同时circHIPK3可以特异性地海绵化miR-185，沉默miR-185可以逆转circHIPK3对上述蛋白的抑制作用，说明circHIPK3可以通过miR-185促进DN的进展[15]。Liu等[16]证实circ_0080425的表达与DN的进展相关，并对系膜细胞增殖和纤维化产生积极影响。进一步研究表明，circ_0080425充当miR-24-3p的海绵，抑制miR-24-3p表达，影响下游成纤维细胞生长因子11（fibroblast growth factor 11，FGF11）的表达，进而促进肾系膜细胞增殖和纤维化，而FGF11的敲除导致细胞增殖率和纤维化明显降低，说明circ_0080425与miR-24-3p的竞争性结合可以从miR-24-3p的抑制中释放FGF11，从而促进DN的进展。Peng等[17]研究发现在高糖条件下培养的糖尿病肾脏、系膜细胞和肾小管上皮细胞中circRNA_010383表达水平明显下调；过表达circRNA_010383抑制了db/db小鼠的蛋白尿和肾纤维化，提示circRNA_010383可能是未来DN治疗的新靶点。上述结论表明circRNA可能参与DN系膜细胞的增殖和纤维化。Chen等[18]报道上调的circLRP6通过在高糖条件下海绵化miR-205来调节系膜细胞损伤，同时通过海绵化miR-205、上调高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和激活toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号途径来调节高糖诱导的系膜细胞增殖、氧化应激、ECM积聚和炎症。此外，有研究报道circAKT3作为miR-296-3p的海绵，通过调节miR-296-3p/E-cadherin信号抑制DN系膜细胞外基质的积聚，为DN的临床诊断靶点和治疗生物标志物提供了新的潜在机会[19]。这些结果提示circRNAs可能是DN发病的关键调控因子，为进一步了解DN的发病机制提供了依据。

2.2 circRNAs与视网膜病变糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常发生的并发症之一，是导致患者视力损害和失明的主要原因。DR主要是由于高血糖条件下视网膜微血管循环改变，包括内皮细胞增殖和通透性增加、异常新生血管和水肿；血糖水平升高会导致氧化应激、炎症、神经元功能障碍、视网膜神经节细胞凋亡和胶质细胞激活[20]。Gu等[21]通过环状RNA表达谱芯片分析19例DR患者和无DR患者血清中的差异表达水平，结果发现30个显著上调的circRNAs，提示这些circRNAs参与DR的疾病进展。Wu等[22]通过对DR患者和非DR患者的全血进行高通量全转录组测序检测circRNAs的差异表达情况，并通过qRT-PCR对候选circRNAs进行验证。结果发现，circ_0001953在区分DR患者与非DR患者和健康对照者时具有较高的诊断准确性。说明全血circ_0001953可作为DR患者新的诊断标志物和潜在的治疗靶点。Zhang等[23]确定了529个在DR和非DR患者之间差异表达的circRNAs，实验证实circ_0005015在DR患者的血浆、玻璃体样本以及纤维血管膜中高表达，其作为miR519d3p的海绵吸附体，抑制其活性，引起miR519d3p下游靶基因基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）和信号转导转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表达上调，从而调节内皮细胞增殖、迁移和基质胶管形成，促进视网膜内皮血管生成。circDNMT3B在糖尿病视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）中表达下调，且circDNMT3B过表达可减少糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞数量，减轻视觉损伤。circDNMT3B作为miR-20b-5p海绵，促进BAMBI表达而导致糖尿病视网膜血管功能障碍，提示circDNMT3B可作为DR潜在的治疗靶点[24]。circZNF532在糖尿病应激下的周细胞、糖尿病小鼠模型的视网膜血管和糖尿病患者的玻璃体房中的表达上调，其充当miR-29a-3p海绵并诱导硫酸软骨素蛋白聚糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）、赖氨酰氧化酶样蛋白2（Lysyl oxidase-like 2，LOXL2）和细胞周期蛋白依赖激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）的表达，从而改善糖尿病玻璃体诱导的视网膜周细胞变性和血管功能障碍[25]。葛慧敏等[26]发现circPWWP2A通过海绵样吸附miRNA-579以发挥竞争性内源RNA（ceRNA）的作用，导致下游靶基因Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1表达的增加，从而参与调控周细胞功能及周细胞与内皮细胞间的串扰，进而加重了糖尿病性视网膜微血管病变的过程。说明诱导circZNF532和circPWWP2A可成为一种新的DR治疗方法。细胞凋亡、炎症和氧化应激是DR进展的标志。结果发现circRNA_0084043的缺失显著提高了内皮细胞存活率，抑制了高糖诱导的细胞凋亡，降低氧化应激活性，有效抑制高糖刺激的炎症反应；同时研究发现circRNA_0084043能够通过海绵化miR-140-3p和诱导视网膜内皮细胞转化生长因子α（transforming growth factorα，TGFA）表达参与DR的进展[27]。circHIPK3在糖尿病视网膜中的表达显著上调，并作为内源性miR-30a-3p海绵，导致血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）和无翅基因相关整合位点2（Wnt2）表达增加，从而导致炎症和血管功能障碍[28]。另有研究报道circZNF609在糖尿病小鼠视网膜血管细胞及高糖培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中表达明显上调，circZNF 609可充当内源性miR-615-5p海绵并抑制其表达，导致肌细胞增强因子2基因（myocyte specific-enhancer factor 2，MEF2A）表达增加，促进病理性血管生成和内皮细胞氧化应激损伤，从而促进DR进展[29]。目前大多数学者的研究均集中在circRNAs通过ceRNA机制，调控其下游靶基因的表达进而参与DR进展。circRNAs在DR发生、发展中的其他分子机制有待更深入的研究。

2.3 circRNAs与糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）DPN是糖尿病最常见、最棘手的并发症，约1/3的糖尿病患者患有DPN，给糖尿病治疗带来巨大的经济负担[30]。目前有关circRNAs在周围神经病变研究较少。Zhang等[31]通过对野生型和糖尿病小鼠进行高通量测序鉴定差异表达circRNAs，结果共鉴定出15个差异表达的circRNAs以及133个差异表达的mRNAs，提示circRNAs可能参与了DPN mRNA表达的调控。外源性沉默circRNA ACR可以降低miR-145-3p的表达，激活PI3K/AKT/mTOR信号通路来减轻高糖引起的大鼠雪旺细胞系细胞RSC96的细胞凋亡、自噬和以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成[32]。糖尿病神经痛是晚期神经病变，严重影响患者的生活质量。Wang等[33]研究发现circHIPK3在患有神经源性疼痛的糖尿病患者血清和链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠背根神经节中高表达，且circHIPK3表达上调与2型糖尿病患者的神经源性疼痛程度呈正相关。circHIPK3在STZ诱导糖尿病大鼠背根神经节表达水平及疼痛评分明显增加，而沉默circHIPK3可降低疼痛评分，减少DPN所致的神经型疼痛。研究发现慢性坐骨神经压迫损伤大鼠模型（chronic compression injury，CCI）中circ_0005075明显增加，下调circ_0005075表达能够诱导miR-151a-3p表达下调和阻断NOTCH2，从而导致靶向环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、白介素6（interleukin 6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的下调来抑制神经炎症，缓解神经源性疼痛[34]。此外，Wei等[35]类似的研究发现在CCI大鼠模型中circZRANB1表达下调，其通过海绵状吸附miR-24-3p，调控LPAR3表达，介导Wnt5a/β-Catenin信号通路促进神经病理性疼痛。上述这些研究结果说明circRNAs在DPN及其神经病理性疼痛中可能发挥重要的调控作用，其具体的相关机制有待进一步的探究。

3 展望

近年来，随着高通量技术和生物信息学的快速发展，研究者发现许多circRNAs在糖尿病及其并发症的发生、发展过程中发挥着关键的角色，深入探究circRNAs在糖尿病及其微血管并发症中的作用及具体分子机制，将有希望为糖尿病微血管并发症的防治工作提供参考和理论依据。然而，既往大多数研究均集中在circRNAs通过竞争性内源RNA机制参与糖尿病血管并发症疾病进展，并且关于circRNAs生物学功能尚处在研究阶段。因此，需要进一步探索并揭示circRNAs在糖尿病微血管并发症的确切机制，circRNAs能否成为糖尿病微血管并发症诊断、治疗和预后的标志物，仍是未来需要不断探索的问题。