蛋白激酶C-βⅡ在糖尿病肾病中的研究进展

姜乐临 叶凡豪 韩丝丝 黄时伟

在临床诊断与介入治疗中，对比剂的应用较多，其主要通过肾脏排泄。对比剂肾损伤是指使用对比剂48 h内发生的肾功能损害，表现为血清肌酐绝对值增加至少44 μmol/L或相对基线增加至少25%。该病是住院患者急性肾功能不全的第三大原因[1-2]。糖尿病是对比剂介入后肾功能障碍的主要危险因素之一，而蛋白激酶C-βⅡ（protein kinase C βⅡ，PKC-βⅡ）在糖尿病肾病中起着重要作用，本文就其相关研究进展作一综述。

1 PKC-βⅡ结构及分子功能

PKC-βⅡ是单个多肽链，包含由5个可变区（V1～V5）间隔的4个保守结构域（C1～C4）。假底物结构域C1、C2、V1、V2、V3的一部分构成调节结构域，存在于氨基末端。C3、C4、V4和V5在羧基末端形成催化结构域，并且这2个结构域通过蛋白水解敏感铰链区连接。

假底物占据C1结构域的末端并介导酶的自动抑制，它与蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）底物具有序列同一性，丙氨酸取代丝氨酸/苏氨酸磷酸受体位点。因此，在酶的无活性状态下，假底物结构域阻断底物结合腔并在活化过程中从活性位点释放并引起酶的完全活化[3]。C1结构域（约70个氨基酸）是紧凑的，富含半胱氨酸并由5个短β链、α螺旋和2个Zn2+组成，并形成DAG和PD结合位点。C1结构域分为2个部分，即C1a和C1b，共享高度的序列相似性。中心体蛋白Pericentrin、RING指蛋白是与C1a区相互作用的2种蛋白[4]，前者负责纺锤体形成和胞质分裂，这种相互作用的破坏可抑制细胞分裂；后者过表达导致PKC-βⅡ蛋白化和降解。因此，通过与PKC-βⅡ的C1结构域结合，这些蛋白质可以改变酶的亚细胞定位和活性[4]。C2结构域由通过环连接的8个反平行β链形成，其由多个天冬氨酸残基排列，而天冬氨酸残基与3个Ca2+配位来充当C2结构域和磷脂头部基团之间的桥梁。活化C激酶（RACK）-1（36 kDa）受体的蛋白质由7个重复的WD40基序组成，以螺旋桨状结构排列，与PKC-βⅡ相互作用并稳定其活性形式，从而提高基质的磷酸化效率。C3结构域被认为是三磷酸腺苷结合的高度保守位点，且该结构域的序列对于PKC-βⅠ和PKC-βⅡ同工酶是相同的[5]。三磷酸腺苷结合位点突变可消除激酶活性。C4结构域是底物结合位点，参与磷酰基转移。它是所有PKC中的保守区域，具有105～108个氨基酸的保守序列，这些序列在三磷酸腺苷结合位点末端开始并持续至磷酸转移基团的开始。V5区域由50～70个氨基酸组成，在PKC的定位和磷酸化中起重要作用。它具有多种功能，具有不同异构体的功能，也可导致酶在不同组织中以不同方式定位。Kiley等[6]分析了V5区域对人U937单核细胞系的影响，结果显示PKC-βⅠ定位于微管，PKC-βⅡ部分定位于分泌颗粒。Blobe等[7]在MOLT-4 T淋巴母细胞样细胞系中也证实了这种定位效应，观察到PKC-βⅡ而非PKC-βⅠ在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理细胞后易位至肌动蛋白微丝。铰链区由残基422-425限定，残基422-425连接调节区和催化区。它被蛋白水解酶破坏，并被确定为半胱氨酸蛋白酶依赖性切割、酪氨酸磷酸化和蛋白质-蛋白质相互作用的靶标。

2 PKC-βⅡ作用机制及通路

PKC在平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞等细胞中广泛表达，在细胞内信号转导中起重要作用[8]。PKC有3个不同的亚型：常规PKC（α、βⅠ/Ⅱ、γ）、新型PKC和非典型PKC[9]。高糖环境可导致组织中二酰甘油水平普遍升高，进而激活PKC-β。

PKC-β能够激活一系列下游信号通路，引发多组织器官发生病变，引起糖尿病相关并发症（如糖尿病肾病等）。因此，糖尿病肾病的新型治疗药物研究早期集中在PKC上[10-11]。某实验在糖尿病2型大鼠模型中观察到晚期糖基化终产物的积累和多元醇通路的激活，同时PKC-β表达增加，促炎症介质（如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6等）被释放，肾脏出现炎症反应，进而导致蛋白尿和肾纤维化[12]。上述结果提示PKC-β与肾纤维化有关。在糖尿病大鼠模型中，高血糖导致糖尿病肾病加重，肾小球内皮细胞凋亡，提示PKC-β通过加剧肾小球内皮细胞凋亡进导致糖尿病肾病。

3 PKC-βⅡ抑制剂LY333531

LY333531是PKC-βⅡ特异性抑制剂，通过与PKC-βⅡ的活性位点结合，进而干扰三磷酸腺苷的结合并抑制底物的磷酸化。目前LY333531已在糖尿病肾病的多种啮齿动物模型中进行测试，包括链脲佐菌素大鼠，链脲佐菌素-REN2大鼠（链脲佐菌素导致糖尿病的遗传性高血压模型）、db/db小鼠（一种发展为糖尿病和肾脏疾病的肥胖遗传模型）等，结果显示肾小球高滤过率正常化，同时蛋白尿、转化生长因子-β和细胞外基质蛋白减少[13]。此外，LY333531治疗还能减少系膜扩张，改善肾小球硬化和肾小管间质纤维化。加用血管紧张素转化酶抑制剂后，LY333531能进一步减少蛋白尿，缓解肾小球硬化严重程度和内皮细胞丢失。相关研究表明，在敲除PKC-β基因或用PKC-β抑制剂治疗的糖尿病大鼠中，肾脏肥大、肾小球超滤、细胞外基质产物及活性氧的生成减少，糖尿病肾病得到缓解[14]。在糖尿病大鼠模型和人肾近端小管上皮细胞培养中，研究发现还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧 化 酶、PKC-β、p66shc表达均明显增加；而PKC-β抑制剂能逆转高浓度葡萄糖诱导的p-p66shc/p66shc、NADPH氧化酶升高[15]。在细胞培养模型中，大鼠系膜细胞转化生长因子-β和细胞外基质蛋白表达均明显增加，以应对糖尿病状态下的高血糖和其他异常代谢产物（如增加的氨基酸和晚期糖基化终产物等）[16]。

在糖尿病小鼠中，高血糖引起肾病加重、肾小球内皮细胞凋亡的同时，伴随着促凋亡蛋白Swiprosin-1表达显著增加。而LY333531能减少糖尿病小鼠中肾小球内皮细胞凋亡，降低Swiprosin-1表达。肾小球内皮细胞中Swiprosin-1过表达，可导致细胞凋亡以及半胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3和Bax表达均明显增加。相反的，Swiprosin-1的敲除可减弱高葡萄糖或PMA诱导的肾小球内皮细胞细胞凋亡。此外，Swiprosin-1过表达可促进Swiprosin-1和半胱氨酸蛋白酶-9之间的相互作用，增加凋亡小体的形成。与糖尿病Swiprosin-1+/+小鼠相比，糖尿病Swiprosin-1-/-小鼠肾脏重量/体重降低，尿蛋白、肾小球肥大、线粒体凋亡相关蛋白以及肾小球内皮细胞凋亡均明显改善[17]。在糖尿病肾病早期，Swiprosin-1表达被PKC-β上调，同时PKC-β通过线粒体依赖性途径促进肾小球内皮细胞凋亡[17]。在人肾小球系膜细胞中，葡萄糖和（或）转化生长因子-β1诱导PKC-α、PKC-β的基因表达增加，使用siRNA法能减弱其表达[18]。相关数据表明，PKC-α或PKC-β在糖尿病肾病患者蛋白尿和细胞外基质积聚的发病机制中起关键作用[19]。Wang等[17]研究发现，LY333531能显著降低糖尿病大鼠血清肌酐水平、肾脏重量/体重和尿蛋白排泄量，且下调转化生长因子-β1、Smad2和Smad3 mRNA表达，预防GRAP蛋白表达降低。有文献报道LY333531的肾脏保护作用可能是由于转化生长因子-β1/Smad通路的下调和GRAP蛋白表达的正常化实现的[20]。

4 小结

PKC-βⅡ在糖尿病肾病的发生、发展过程中发挥重要作用。PKC-βⅡ抑制剂LY333531可以通过抑制PKC-βⅡ的激活来阻断下游信号通路，从而起到治疗糖尿病肾病的作用。随着PKC-βⅡ相关研究的深入，PKC-βⅡ特异性抑制剂治疗糖尿病并发症将有更广阔的前景。