内分泌干扰物对鱼类性腺干扰的分子作用机制

杨超超，潘鹏涛，谭 婷，杨 娜，雷 忻*

(1.延安大学 生命科学学院；2.延安市生态恢复重点实验室，陕西 延安，716000)

内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)，是一类能够通过对性激素的合成、分泌、运输及代谢等途径产生干扰从而影响动物正常生命活动的外源性化学物质[1]。EDCs又称环境激素，多数EDCs表现出雌激素活性，少数EDCs则表现出雄激素活性。部分EDCs可在水环境中长期存在，并可借助食物链的放大作用在鱼体内富集，对鱼类性腺和生长繁殖产生较大影响[2-3]。本文就EDCs对鱼类卵黄蛋白原、性类固醇激素、性腺相关基因的干扰作用研究现状进行综述，旨在为EDCs干扰鱼类性腺发育和生殖活动的相关研究提供参考资料。

1 EDCs对鱼类卵黄蛋白原的影响

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)是大多数卵生动物卵黄蛋白的前体，主要由雌激素诱导、在动物肝脏中合成，但雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)并非只存在于雌鱼肝脏，其在幼鱼和雄鱼体内也有存在，因此，雄鱼和幼鱼在外源雌激素或雌激素类似物诱导下，雌激素类似物与性类固醇激素结合球蛋白结合，继而与肝脏内的ER形成复合物，在二聚化后结合到位于Vtg基因启动子附近的雌激素反应元件的基因组DNA序列上，之后经二聚体化、脂化、磷酸化和糖基化，导致其肝脏也能分泌Vtg[4-5]。

大量研究表明，EDCs可以对鱼类Vtg水平产生显著影响，并可能导致雌鱼卵巢增重等现象，这种效应在一定程度上受暴露时间及浓度等因素影响。通过对雄性罗非鱼进行更新式水体暴露染毒试验发现，灭多威使雄性罗非鱼Vtg水平显著上升[6]。对雄性金鱼进行久效磷暴露可诱导Vtg在其肝脏中合成，并导致雌性金鱼卵巢增重[7]。滴滴涕(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)暴露能够诱导雄性唐鱼产生Vtg[8]。菲(Phenanthrene，Phe)暴露可诱导雄性泥鳅Vtg的合成[9]。随着辛基酚(Octylphenol，OP)暴露剂量增大和时间延长，雄性泥鳅Vtg合成有增强趋势[10]。壬基酚(Nonyl Phenol，NP)处理能显著诱导雄性幼龄泥鳅血清Vtg水平上升，且诱导效应与浓度在一定范围内成正比[11]。这说明以上几种EDCs均表现出类雌激素性质，可以诱导Vtg的合成。

而EDCs对Vtg水平的影响可能与Vtg基因有一定关系。Vtg基因上调可促进Vtg的生成，下调表达的结果则相反，而EDCs可以调控Vtg基因的表达，这种调控因EDCs种类及暴露浓度等因素出现不同结果。李栋[12]研究发现2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)暴露不仅提高了性分化期斑马鱼Vtg水平，也上调了Vtg基因表达。夏爽[13]研究发现草甘膦暴露能促进青鳉幼鱼肝脏Vtg基因表达。而2种三唑类杀菌剂(己唑醇，苯醚甲环唑)暴露均能诱导雄性斑马鱼肝脏Vtg1和Vtg2基因表达水平显著升高，且Vtg1比Vtg2更敏感[14]。但也有研究指出，随三唑酮暴露浓度的升高，斑马鱼群体Vtg1基因表达量受到抑制[15]。而EDCs对Vtg水平的影响也可能与受试动物种类及性别有一定关系，研究表明，一定浓度的阿特拉津(atrazine，ATZ)暴露对雌性斑马鱼肝脏Vtg1和Vtg2基因的表达具有显著诱导效应，但未显著影响雄鱼肝脏Vtg1和Vtg2基因的表达量[16]。而少量ATZ暴露可显著诱导雄性斑马鱼肝脏Vtg基因的表达上调[17]。

由此可见，EDCs对鱼类Vtg的调控因暴露浓度以及EDCs类型等而有所差异，大多数雌激素类EDCs都会使Vtg基因上调从而导致Vtg水平升高，雄激素类EDCs会下调Vtg基因的表达从而导致Vtg水平降低，这可能是因为雌激素类EDCs可以使ER复合物增加，并促进二聚体化、脂化、磷酸化和糖基化等过程，而雄激素类EDCs对其有抑制作用。而Vtg合成过程需要一定物质以及能量，因此过早或过量的合成Vtg都会影响鱼类的正常发育，甚至可能导致雄鱼的雌性化。

2 EDCs对鱼类性类固醇激素的影响

性类固醇激素对鱼类性腺分化、发育等过程具有极其重要的影响，其合成以胆固醇为前体物质，经侧链缩短，先形成孕酮或孕烯醇酮，再脱去一个侧链变成雄激素，最后经A环芳香化途径生成雌激素，且雌激素与雄激素在鱼类体内可以相互转换。目前，睾酮(Testosterone，T)、11-酮基睾酮(11-ketotestosterone，11-KT)、雌酮(Estrone，E1)、雌二醇(Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)等性类固醇激素是鱼类中研究较多的几类[12]。而EDCs可能会通过对性类固醇激素的调控对鱼类的生长发育产生一定的影响，这种调控在性类固醇激素受体及其相关基因方面也有一定的体现。

大量研究发现，EDCs会影响鱼类雄激素水平及其受体基因表达水平，大多表现为对雄激素及其受体基因表达水平的抑制作用。高浓度ATZ暴露可导致斑马鱼体内雄激素水平降低[17]。李栋[12]研究表明不同浓度2,4-DCP 暴露均导致斑马鱼体内11-KT以及T水平下调。久效磷暴露也可使雄性金鱼T合成受到抑制，而雄激素T含量的降低可能是由于久效磷对类固醇生成途径的抑制所导致的效果[18]。又有研究证明一定浓度双酚A(Bisphenol A，BPA)暴露可以抑制稀有鮈鲫雄激素受体(Androgen Receptor，AR)的表达从而扰乱性激素合成相关基因的表达[19]。且NP与BPA暴露均可显著下调稀有鮈鲫幼鱼AR基因的mRNA表达[20]。

EDCs对鱼类雌激素水平及受体基因也具有一定调控作用，大多数表现为促进雌激素生成，上调雌激素受体基因的表达。研究表明，2种三唑类杀菌剂(己唑醇，苯醚甲环唑)暴露均能造成斑马鱼血浆E2含量增高；而在分子层面上，己唑醇和苯醚甲环唑暴露都可使斑马鱼肝脏ERα和ERβ1基因表达量显著上调[14]。呋喃丹暴露可使斑马鱼E2含量显著上升，上调斑马鱼ER基因表达[21]。但戊唑醇暴露导致斑马鱼雌鱼ERβ基因的表达显著下调，且通过抑制cyp19表达，进一步加剧E2水平的下调，从而体现其抗雌激素效应[22]。关于cyp19与ER的关系，有研究表明，BPA暴露可影响斑马鱼cyp1基因的表达，从而干扰ERs的响应和性腺E2合成[23]。戴奇的研究也证实了这种观点，暗纹东方鲀雌鱼体内cyp19a的高度表达，产生大量的芳香化酶，催化雄烯二酮和T向 E1和E2转化[24]。而三丁基锡(tri-n-butyltin hydride，TBT)暴露处理可显著降低cyp19amRNA在孔雀鱼卵巢中的表达水平，导致芳香化酶将T转化为E2的效率下降，从而显著降低雌鱼E2水平[25]。而EDCs对鱼类雌激素的影响也因EDCs的联合暴露呈现不同的结果，TBT与NP联合暴露使斑马鱼ERα的合成基因esr1基因的表达量较NP单独暴露呈下调趋势[26]。而esr1基因下调可导致鱼类卵巢的退化，有研究表明，雌性斑马鱼esr1缺失导致卵巢功能的退化与mTOR信号通路相关[27]。

而EDCs也可通过调节性类固醇激素相关基因的表达来调控影响性类固醇激素。研究发现，一定浓度BPA暴露可以抑制雌性稀有鮈鲫性类固醇激素合成相关基因的转录因子表达[19]。而NP暴露可干扰类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein，StAR)及胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side chain cleavage enzyme，P450scc)表达，从而对鱼类卵巢激素的合成产生影响，且P450scc和StAR基因的表达模式与11-KT水平也存在伴随浓度特异性的直接关系[28]。这可能是因为高浓度的雌激素类EDCs会抑制类固醇激素相关基因的表达，从而降低了胆固醇向孕酮以及雄激素的转化，最终影响了卵巢激素的合成。

由此可见，芳香化酶、固醇酶与ER、esr1等在性类固醇激素的产生中发挥着重要作用，而mTOR等信号通路也是其变化的因素之一。一定浓度的雌激素类EDCs通过促进相应的性类固醇生成途径或降低AR的表达量从而促使了雄激素向雌激素转化，最终导致雄激素含量降低；且雌激素类EDCs可以通过促进ER及cyp19a、esr1等基因的表达，加速雄激素向雌激素的转化，而雄激素类EDCs在这个过程中起相反作用。但某些EDCs可能具有两重性，表现为低浓度促进，高浓度抑制，这可能是因为过高浓度的EDCs对鱼体的内分泌系统产生了严重损伤。

3 EDCs对鱼类性腺发育相关基因表达的影响

对大多数鱼类来说，性腺是生殖内分泌调控过程中重要的靶器官，性腺相关基因mRNA具有高度不稳定性，不同环境胁迫下，基因表达水平会出现一定差异，而转录组可以在一定程度上反映出这些变化特点。目前，在转录组学研究中应用较多的是RNA高通量测序技术(RNA high-throughput Sequencing，RNA-seq)，RNA-seq有助于从转录组水平了解EDCs对上调基因、下调基因等的影响[29]。

3.1 EDCs对精巢发育相关基因的影响

一些基因对于精巢的形成以及发育具有重要作用。Sox9基因对雄性个体的正常发育具有诱导效应，当Sox9基因异常表达时可致使动物发生性反转现象(Double-sex and Mab-3 related transcription factor,dmrt)基因可能与精巢足细胞发育有关，gsdf基因能够诱导精巢组织的分化，抗苗勒氏管激素基因(AMH)的过表达会抑制勒氏管分化，刺激中肾管分化成雄性生殖器[30-33]。不仅如此，主要在卵巢中表达的cyp19a1a对于精巢的形成以及发育也有一定作用。由此猜测，鱼类精巢的异常发育可能是由于EDCs对精巢相关基因的影响，这种影响可能表现为抑制或促进Sox9、cyp19a1a等基因的表达。

EDCs可以影响鱼类Sox9 、dmrt1等精巢相关基因的表达，这种影响与cyp19a1a等基因存在一定关系，且浓度、温度、鱼种类及EDCs种类等因素也会对精巢相关基因的表达产生不同影响。研究发现，不同EDCs对鱼类相同基因具有不同的影响效果，来曲唑(Letrozole，LET)暴露使金钱鱼幼鱼Sox9基因表达量显著上升[34]。而ATZ暴露可下调雄性斑马鱼Sox9a基因表达，并减少精原细胞数量，增加精小管管间间隙[17，35]。除Sox9基因外，氯咪巴唑暴露导致雄性斑马鱼精巢中cyp19a1a等基因的转录表达上调[36]。温度可能也是影响EDCs对基因调控的因素之一，高温和甲基睾酮(MT)暴露联合处理，可显著上调尼罗罗非鱼幼鱼dmrt1基因表达水平，并显著下调cyp19a1a基因表达水平[37]。此外，王伟伟[38]也通过高通量测序法证实了尼罗罗非鱼中dmrt1基因与cypl9a1a基因的表达成负相关。这说明，雄激素类EDCs可能上调精巢相关基因的表达，而雌激素类EDCs对其有抑制作用；而精巢内cyp19a1a基因的上调表达可促进芳香化途径从而对精巢产生损伤，进而抑制其基因表达。BPA对暗纹东方鲀雄鱼暴露发现，dmrt1和cyp19a基因先下调后上调[39]。这可能是因为雌激素类EDCs可以抑制雄鱼体内雄激素水平，从而致使短时间内雌激素水平的下降，进而导致dmrt1和cyp19a基因下调，但一段时间后，雌激素类EDCs诱导雌激素含量上升，这在一定程度上加速了雄激素的合成，最终上调了dmrt1和cyp19a基因的表达。BPA暴露可促进cyp19a等相关基因在斑马鱼精巢中表达，且浓度升高时基因mRNA表达量显著上调[40]。由此可见，浓度是影响精巢发育相关基因表达的重要因素，而cyp19a因鱼种类的不同而产生的差异性表达，可能是因为不同鱼类内分泌系统具有不同的调节阈，这也间接说明了EDCs对不同鱼类体内精巢相关基因的影响存在一定程度上的差异，但大部分表现为抑制效应。

上述研究报道表明，EDCs可能导致精巢相关基因的表达上调，也可能下调其表达。EDCs性质以及鱼的种类是影响调控的重要因素，暴露浓度以及温度等条件可能是其制约条件，且cyp19a1a等基因与精巢相关基因之间存在一定关系。

3.2 EDCs对卵巢发育相关基因的影响

卵巢相关基因是动物卵巢产生及生长、发育的重要因素。foxl2基因是卵巢分化和维持过程中的关键基因，cyp19a1a基因可能参与了卵巢发育、雌性特征维持等过程，Sox9等基因在此过程也起到一定作用[41-43]。

cyp19a等卵巢发育相关基因可随EDCs种类等因素的不同呈现不同的表达结果，与芳香化酶抑制剂作用相似的EDCs对卵巢发育相关基因的影响具有相似性，其在一定程度上可以抑制卵巢发育相关基因表达，这可能是通过促进dmrt1等基因表达或影响基因甲基化水平等信号通路来实现的。在EDCs对雌鱼基因的研究中发现，属于雌激素类EDCs的ATZ暴露对斑马鱼卵巢中cyp19a基因的上调表达产生了诱导效应[16]。长期及高浓度雄激素类EDCs来曲唑(Letrozole，LET)暴露使黄河鲤雌性相关基因的表达下调，而ATZ的影响则相反[44]。关于ATZ和LET对生物性腺发育相关基因的影响，王菊等[45]的研究中也出现了类似结果。这恰恰说明不同性质的EDCs具有不同的效果，但一定浓度的雌激素类EDCs(BPA和NP)可能与LET具有相似的性质，BPA能够通过调整斑马鱼cyp19ala基因DNA甲基化水平影响其表达，赵飞[23]研究发现一定浓度BPA暴露使斑马鱼卵巢cyp19alamRNA水平显著降低。同样，暴露于NP环境3 d后，鲫鱼卵巢中控制芳香化酶mRNA表达的cyp19ala基因也明显受到抑制[46]。这与前文中BPA与NP对性类固醇激素相关基因的影响结果相同，这提示我们某些雌激素类EDCs可在一定浓度时抑制cyp19ala的表达。又有文献表明，17α-MT暴露导致cyp19a1a基因在黄姑鱼雌鱼中的表达受抑制，而增强dmrt1基因表达，使Sox9a、Sox9b基因在雌性大黄鱼性腺中的表达显著上调，并诱导Sox9和amh基因表达，使其在伪雄性虹鳟鱼性腺中的表达量显著高于雌性虹鳟[30，47，48]。这在一定程度上说明LET等性质相似的EDCs与17α-MT具有相近的毒性作用，其通过促进dmrt1等基因表达或影响基因甲基化水平来抑制卵巢发育相关基因的表达。

3.3 EDCs对鱼类性逆转的诱导作用

性逆转是指动物雌雄个体在一定条件下相互转化的现象。在性腺性分化期用EDCs处理幼鱼可起到性逆转作用，但具体的诱导机制目前尚没有准确定论。雌激素类EDCs暴露可能会导致处于性分化时期的鱼类发生由雄性到雌性的转变，雄激素类EDCs暴露诱导鱼类由雌性到雄性的转变，两种不同类型的EDCs互相起拮抗作用。谷伟等证实17α-MT暴露可以诱导雌性虹鳟鱼的雄性化[48]。李广丽等[49]通过对2龄赤点石斑鱼雌鱼腹部埋植17α-MT处理，发现17α-MT可对赤点石斑鱼性逆转具有不同程度的诱导效应。LET处理使金钱鱼性腺出现不同程度的由雌性向雄性的性逆转，表现为卵母细胞退化，精原细胞出现[34]。然而有研究表明，某些EDCs的作用表现出互相拮抗。李栋发现不同浓度的2,4-DCP暴露均可导致斑马鱼雌性化；但与单一2,4-DCP处理相比，不同浓度2,4-DCP与法倔唑联合暴露均使雌性斑马鱼的比例极显著下调，致使斑马鱼性别比例向雄性偏转[12]。

而EDCs对鱼类的性逆转的诱导机制可能与foxl2、cyp19a、amh、gsdf等基因有关，雄激素类EDCs可通过改变cyp19a等基因的表达使鱼类发生由雌性到雄性的性逆转。研究表明对金钱鱼性腺基因分析发现，amh、gsdf、Sox9b等基因在雌性生殖器中的表达量明显低于雄性，而foxl2、cyp19a等基因在卵巢中表达水平更高[50]。而LET暴露可通过改变cyp19a基因的表达，影响暗纹东方鲀仔幼鱼的性别分化，降低雌性比例，且不同暴露时间和浓度对雌性比例的影响也不同[51]。大于100 μg/g剂量的腹部埋植LET对胡子鲇向雄性分化具有显著诱导效应，cyp19a1b在其性腺分化中可能起间接作用，但foxl2是其性腺分化的直接因素[52]。而17α-MT调控雌激素的生物合成从而影响胡子鲇性分化也与foxl2的表达受抑制有关[53]。这说明一定浓度的雌激素类EDCs可通过抑制amh、gsdf等雄性相关基因的表达，促进foxl2、cyp19a等雌性相关基因的表达，并通过促进雄性激素向雌性激素转化、诱导雄性鱼类Vtg生成等多种途径联合的方式来抑制雄性性腺的分化或诱导雌性性腺的分化；而雄激素类EDCs作用相反。

4 展望

目前，学者们就EDCs对鱼类性腺开展了上述Vtg、性类固醇激素以及性腺相关基因研究，得出大量有价值的结果，但也存在一些问题：(1)目前，对鱼类Vtg的研究集中在Vtg水平及相关基因的表达方面，而对Vtg受体、受体基因及其与Vtg之间的调控关系的研究报道相对较少；(2)目前对各种EDCs性质未有明确认识，同性质EDCs不同浓度下暴露对鱼类的影响机制还不太明确，不同类的EDCs的联合作用也具有不确定性，可能表现出协同、拮抗、相加等不同的效果；(3)目前EDCs对雄性决定基因及相关基因的研究较少。因此，未来可以在以下三个方面就EDCs对鱼类性腺干扰的分子作用机制进行深入研究：(1)进一步对Vtg受体及基因进行研究。(2)深入研究EDCs联合毒性对性腺的作用机制。(3)深入研究EDCs对雄性决定基因以及相关调控基因的影响作用。