长链非编码RNA对间充质干细胞成骨分化的影响

王健雄 徐胜前

炎症和新骨形成是强直性脊柱炎的疾病特征，异位骨化和新骨形成也是导致强直性脊柱炎患者脊柱强直乃至残疾的主要原因[1]，但典型的影像学改变常出现在疾病发生多年之后，因此探讨其成骨机制对强直性脊柱炎的早期治疗及预防脊柱强直的发生具有重要意义。具有自我更新和多向分化潜能的间充质干细胞来源于中胚层，在骨膜、肌肉、外周血及全身结缔组织等多处均有存在。如骨髓间充质干细胞作为生殖成纤维细胞的多能祖细胞，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，是成人骨髓中能分化为成骨细胞和脂肪细胞的主要干细胞来源[2]。这些干细胞对骨关节疾病异位骨化和新骨发生的影响及其参与调控的机制一直在探讨中。近年来，随着生物信息学、表观遗传学的发展，目前已有不少研究显示长链非编码RNA(LncRNA)与成骨、成肌、脂肪生成相关。炎症、辐射射线等因素均可通过影响LncRNA的表达，从而改变成骨分化能力[3]。综上，我们推测LncRNA可能通过影响间充质干细胞的方式参与成骨相关疾病的发生发展。

一、LncRNA的生物学功能

LncRNA是长度>200个核苷酸的非编码RNA。在哺乳动物的基因组序列中，4%～9%序列产生的转录本是LncRNA。LncRNA起初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，人类基因组编码了近50 000个LncRNA，其中大部分具有组织特异性，在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多方面发挥重要作用[4]。LncRNA具有丰富多样的生物学功能：(1)发挥微小RNA(miRNA，miR)的海绵样吸附作用；(2)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；(3)干扰蛋白编码基因的表达；(4)抑制RNA聚合酶Ⅱ或介导染色质重构和组蛋白修饰；(5)与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；(6)与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的小干扰RNA(siRNA)，调控基因的表达水平；(7)结合特定蛋白，调节蛋白活性；(8)与特定蛋白结合，从而改变该蛋白的胞质定位。鉴于这些LncRNA可通过多种方式参与生命体内重要的调控过程，目前已成为研究热点。

二、干细胞来源及其生物学特性

间充质干细胞作为常见的成体干细胞之一，广泛分布于全身各大组织中，如骨髓、牙髓、脂肪。作为生殖成纤维细胞的多能祖细胞，在LncRNA多种途径及骨形成蛋白(BMP)信号通路、Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等多个经典信号通路的参与下，具有分化为多种细胞组织的潜能，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，是成骨细胞和脂肪细胞的主要干细胞来源。如来源广泛的骨髓间充质干细胞，早在1867年，德国病理学家Cohnbeim首次提出了骨髓中存在间充质干细胞，随后的研究证明其具有向中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，以及自我复制能力和多项分化潜能。牙源性干细胞则是牙再生研究中使用最多的种子细胞，包括牙髓干细胞、牙乳头细胞、牙周膜干细胞等，其分化、增殖能力强，免疫原性低，对受植区环境的适应能力强，被认为是可替代骨髓干细胞成为干细胞研究的更好来源之一。其他组织的间充质干细胞、鼠间充质干细胞增殖能力也很强，且具有多项分化潜能，在实验中应用广泛。甚至在既往只因其参与组织的代谢、促进血管生成等作用而受到关注的、来源于脂肪组织中的再生细胞-脂肪干细胞，近期被学者指出，可利用LncRNA调控脂肪干细胞成骨分化，从而应用于干细胞治疗，以减轻骨髓干细胞的提取有创操作所产生的疼痛症状[5]。

三、LncRNA抑制间充质干细胞成骨分化

骨髓间充质干细胞(BMSCs)拥有多重分化潜能和自我更新能力，LncRNA参与其中一系列调节。在最近一项研究中，牛磺酸上调基因1(TUG1)通过与Smad蛋白同源物5(Smad5)的50～90个氨基酸区域互补并阻断其核转位[4]，或结合miR-204-5p调节Runt相关转录因子2(Runx2)的转录后表达，来抑制BMSCs的成骨分化[6]。这种LncRNA-miRNA模式是成骨分化的重要调控途径之一。同样，双荧光素酶报告证实WNT2B是促进BMSCs成骨分化的关键基因，miR-370-3p被认为可以调控基因WNT2B，LINC00707对miR-370-3p的海绵样吸附作用可减少其对WNT2B的负调节，以达到促进成骨分化的作用[7]。通过此方式的还可通过LncRNA PGC1β-OT1调节内源性miR-148a-3p及其靶基因赖氨酸特异性脱甲基酶的表达，导致脂肪蓄积并抑制成骨细胞的分化[8]。针对BMSCs还发现了一些其他的调控方式，如LncRNA SEMA3B-AS1下调肌动蛋白细胞骨架、粘着斑和细胞外基质-受体相互作用的相关蛋白质的表达，增加剪接体中蛋白质的表达，显著改变了成骨过程[9]。LncRNA SNHG1则被证明可通过Nedd4泛素化调控p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路，抑制BMSCs的成骨分化[10]。

在牙周病研讨中，牙周膜干细胞(PDLSCs)是最广为研究的间充质干细胞之一。在该类干细胞的研究中，对LncRNA MEG3的研究广泛而富有争议。有研究报道，MEG3过表达促进了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)下游蛋白IRS1和p-Akt的表达[11]，并可与异质核核糖核蛋白Ⅰ相互影响从而抑制BMP2的表达，降低成骨分化能力。而在Wnt/β-catenin信号通路的研究中，MEG3调节Wnt基因启动子上的H3K27me3水平，以促进PDLSCs成骨分化[12]。既往文献报道，MEG3还可通过结合miRNA的方式，如结合miR-133a-3p、miR-27a-3p参与正调节，结合LY294002参与负调节[11-13]。

在针对瓣膜间充质细胞(VICs)的研究中发现，LncRNA OIP5-AS1可以通过上调miR-137靶基因TWIST1抑制VICs的成骨分化[14]。RUNX2反义链LncRNA RUNX2-AS1在小鼠实验中可被外来体传递给骨髓干细胞，在重叠区域与RUNX2形成RNA双链体，后者通过降低剪接效率抑制转录，导致鼠间充质干细胞成骨潜能降低[15]。而在炎症环境下，LncRNA POIR下调导致循环中miR-182表达水平的进一步增加，使FoxO1基因抑制Wnt/β-catenin信号通路下游细胞周期蛋白D1的表达，进而抑制成骨分化[1]。

四、LncRNA促进间充质干细胞成骨分化

相比抑制成骨分化，既往研究中报道了更多促进成骨分化的LncRNA，它们在不同细胞中调控成骨分化的作用不尽相同。实验中我们常利用几种成骨相关基因确认成骨分化，包括成骨细胞分泌蛋白(OCN)、骨唾液酸蛋白(BSP)和碱性磷酸酶(ALP)的表达等[16]。研究报道在成骨培养时，LncRNA ANCA能调控上游网络促进牙周间充质干细胞成骨分化、脂肪分化和神经分化，可作为miR-758海绵，还可调节Notch2表达。Notch2是Notch2-wnt/β-catenin信号通路的关键因子。LncRNA ANCA对同期培养的牙髓干细胞、根尖乳头干细胞几乎没有影响[17]。通过miRNA海绵作用调控的还包括lncPCAT1组成的前反馈网络，lncPCAT1吸附miR-106a-5p共同调控BMP2和E2F5的表达，E2F5又可以反过来促进lncPCAT1转录的方式诱导牙周干细胞成骨分化[18]。其他一些研究发现，下调TWIST1、上调TUG1都可调节牙周干细胞的成骨分化，被认为在牙周组织工程和骨再生中应用前景广阔[19-20]。

炎症是导致骨疾病的重要诱因之一，通过模拟骨髓炎炎性微环境后的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示，炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1A、IL-6和肿瘤坏死因子分泌增加。茜素红染色和血清碱性磷酸酶(ALP)检测结果表明，炎性微环境抑制了BMSCs的成骨分化。与正常人对照组相比，总共发现了2 033个LncRNA异常表达。在这些LncRNA中，641个被下调，1 392个被上调[21]。H19是哺乳动物发育中最丰富和最保守的非编码转录本之一，H19在细胞生物学中的重要性及其在控制细胞或组织分化中的潜在作用正在研究中，有学者证明了H19在骨形成蛋白9(BMP9)刺激骨髓干细胞的早期阶段急剧上调，随后迅速下降并逐渐恢复到基础水平，该过程与BMP9诱导的成骨表达相关，且能通过Notch信号通路逆转。H19通过调节Notch信号通路的miRNA而充当BMP9信号传导的重要介质。Li等[22]在骨质疏松的研究中发现，H19与Dickkopf相关蛋白4(Dkk4)在切除后肢的小鼠中显著下调和上调。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)结果显示，H19表达水平在3和4周分别降低64.5%和68.4%，而Dkk4的表达水平增加117.8%和426.8%，当Dkk4过表达后，Wnt信号通路下游的3个关键基因(c-Myc、ZEB1和SNAIL)显著下调。提示β-catenin表达的时间依赖性主要发生在第3周后，H19、Dkk4和Wnt信号通路均对废用性骨质疏松至关重要。H19同样也有经典miRNA海绵吸附作用的报道，H19结合miR-675不仅下调Smad3磷酸化以减少组蛋白去乙酰化酶向Runx2靶基因的募集，而且还可抑制组蛋白去乙酰化酶4/5表达。这种作用显著抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，抑制转化生长因子-β1诱导的内源性OCN启动子组蛋白H4的去乙酰化，从而促进成骨分化[23]。在骨质疏松症患者相关的研究中，LncRNA MALAT1也被提及。骨质疏松症患者BMSCs中MALAT1的表达明显降低，miR-30、miR-143是MALAT1的潜在结合分子，敲低MALAT1或过表达miR-30、miR-143会抑制成骨细胞分化[24]。类似地，将人类主动脉瓣膜间质细胞成骨诱导后，也可观察到MALAT1海绵miR-204正向调节Smad4表达，促进成骨分化的作用。针对BMSCs的lncRNA研究还涉及DANCR，在BMSCs成骨分化过程中DANCR表达水平显著降低。通过下调DANCR，BMSCs中S期细胞数量、ALP活性水平、成骨标志物基因mRNA的表达和矿化基质沉积异常增加。其对于成骨分化的调节既不是细胞外调节蛋白激酶依赖性也不是应激活化蛋白激酶依赖性的，而是p38MAPK依赖性的[25]。其他如OG、PRNCR1分别通过人异质核核糖核蛋白K促进启动子H3K27的乙酰化来激活骨形态发生蛋白信号通路(BMP信号通路)和抑制miR-211-5p正向调节CXCR4的方式，上调和下调骨髓间充质干细胞的成骨分化[26]。除了成骨分化，LncRNA也与肌生成、脂肪生成相关[4]，LncRNA KCNQ1OT1通过激活Wnt/β-catenin信号通路和对miR-214海绵样作用促进鼠间充质干细胞(MMSCs)成骨分化[27]。LncRNA TCONS_0004196与miR-204-5p和miR-125a-3p结合增加MMSCs的成骨分化能力，并减弱其脂肪分化。

对于同样分化潜能巨大的LncRNA ADSCs，可通过PCAT1的海绵样作用，吸附miR-145-5p参与的TLR信号通路、HIF1A-AS2与miR-665相互作用导致IL-6增加并激活PI3K/Akt信号通路等方式促进ADSCs成骨分化[23-28]。

五、LncRNA调控间充质干细胞成骨分化相关信号通路

成骨细胞分化受多种基因和信号通路调节。TGF-β/BMP信号通路是依赖于一系列Smad蛋白参与调控成骨分化，包括受体调节的Smads(R-Smads)、共同伴侣Smads(Co-Smads)和抑制性Smads(I-Smads)。通过BMP-2/Smad/Runx2信号通路激活增强人骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化[26]，当成骨信号转导到骨髓干细胞的细胞质中时，Smad5被磷酸化，然后被导入细胞核，诱导、抑制间充质多能细胞和前成骨细胞的成骨细胞分化[29]。在此过程中，Smad5核转位对成骨信号转导至关重要。

Wnt/β-catenin信号通路在人类的成骨分化中起重要的调节作用，是骨折治疗的最常见靶点之一。Wnt/β-catenin信号通路在转录水平上调节成骨细胞相关基因WNT2B蛋白、RUNX2和成骨细胞特异性转录因子(OSX)等的表达。OSX作为RUNX2的下游靶基因，在成骨细胞分化中发挥着重要的调节作用。调节RUNX2的表达后，可促进OSX基因和蛋白的表达水平均升高。Wnt2B可抑制ALP的表达，调节成骨的关键基因如RUNX2和OSX的表达，从而调节骨形成过程。

MAPK信号通路包括JNK、ERK1/2和p38途径，已经成为细胞生理学的主要调控因子，是成骨分化关键的触发因素[25]。特别是p38途径，通过活化MAPK促进蛋白激酶2(MK2)磷酸化，从而抑制MK2造成骨质流失[30]。

虽然TLR信号通路对脂肪干细胞成骨分化方面的研究有限，但一些证据提示TLR4参与骨骼系统的多个生物过程。据报道，TLR信号通路可通过骨钙蛋白将动脉成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。在骨相关感染性疾病中，TLR2和TLR4与成骨细胞中人β-防御素-3的产生增加有关。另有研究报道，过表达热休克蛋白60(HSP60)可使TLR4表达上调，在骨丢失中扮演关键作用。在后续研究中，沉默TLR4几乎可消除HSP60介导的骨间充质干细胞凋亡。

此外，如NOTCH1可以通过改变HES1、HEY1、RUNX2、BMP2、Sox9的表达促进骨化，对骨稳态具有关键调控作用[31]。胰岛素样生长因子1(IGF-1)也可通过ERK和JNK MAPK途径促进骨生成。PI3K/Akt信号通路对骨生成和软骨内骨化也非常重要，有研究报道其通过RUNX2、BMP诱导成骨表达。动物实验也证实，阻断PI3K/Akt信号通路会对骨化造成负面影响[32]。

六、间充质干细胞与疾病

目前的研究集中于发现疾病状态下具有差异表达的LncRNA。如强直性脊柱炎患者的间充质干细胞的成骨分化能力显著高于健康人，这种差异被认为是强直性脊柱炎病理性骨生成可能的基础机制之一。相关研究报道了强直性脊柱炎患者与健康人之间存在差异表达的LncRNA和mRNA，二者被认为参与调控间充质干细胞的成骨分化。膝关节骨性关节炎患者的软骨间充质干细胞也发现类似的成骨能力差异。此外，牙髓间充质干细胞在炎症环境下会失去成骨分化的潜能，且细胞传代9次后仍可观察到该现象。后续研究发现，LncRNA可改善炎症环境中被抑制的细胞的成骨分化能力[21]。最新研究表明，脂肪干细胞可以替代骨髓间充质干细胞作为骨再生的细胞来源，在骨质疏松中脂肪源干细胞拥有更稳定的成骨分化周期[28]。

健康人成骨分化的促进与抑制保持相对平衡，随着更多相关的LncRNA被发现，为骨肿瘤、多发性骨髓瘤、骨关节术后的骨溶解、心脏瓣膜钙化等疾病的预后和治疗方式找到了新的方向。但LncRNA结合miRNA、结合蛋白、介导各个信号通路在间充质干细胞成骨分化中的分子机制仍有待确定。对于间充质干细胞而言，尽管不同来源的间充质干细胞均具有成骨分化潜能，但终究存在各自来源组织的特点，这种差异可能与不同组织的基因、细胞因子、表面受体有关，那么不同来源的间充质干细胞在LncRNA的调控下，应用于同种疾病时是否可以弥补这种差异需要进一步研究。

七、总结与展望

有效避免强直性脊柱炎导致的异位骨化和新骨形成是临床亟待解决的问题，结构损伤严重影响患者的组织功能、身心健康及生存质量。近年来，lncRNA对拥有多向分化潜能的间充质干细胞成骨分化的调控作用已成为研究的热点，进一步深入研究强直性脊柱炎疾病相关的lncRNA及其分子调控机制，为理解强直性脊柱炎的发病机制和开发潜在的生物学标志物提供了新思路。