胰腺囊性病变囊液的分析及其应用价值

郝文真 杨爱明

中国医学科学院北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京 100010

【提要】 由于影像技术的发展及临床广泛应用，胰腺囊性病变的检出率明显提高。部分胰腺囊性病变具有潜在恶性，需要手术切除。确定胰腺囊性病变的性质与级别对于选择合适的治疗方案和手术方式有重要指导意义。随着超声内镜技术的成熟与推广应用，获得囊液进行分析可为判断胰腺囊性病变的性质与级别提供依据。

胰腺囊性病变(pancreas cystic lesion， PCL)在人群中发病率约为2.5%，随着影像技术的发展及临床广泛应用，近些年PCL的诊断率明显提高，其检出率在腹盆CT中为2.2%，在腹部MRI中为19.6%[1]。尸检研究发现，多达1/4的普通人群胰腺中存在未被发现的PCL[2]。PCL包括肿瘤性病变与非肿瘤性病变两大类，非肿瘤性病变又根据囊壁有无上皮组织分为胰腺假性囊肿(pancreatic pseudocyst， PPC)与胰腺真性囊肿。胰腺真性囊肿在PCL中占很小部分，因此PCL诊断的关键在于鉴别假性囊肿与囊性肿瘤。 PPC是急慢性胰腺炎的常见并发症，占PCL的70%以上。急性胰腺炎并发假性囊肿时，发作的6周内，40%假性囊肿会自发消退， 20%患者会出现其他并发症[3]；慢性胰腺炎时，PPC的患病率为20%～40%[4]。胰腺囊性肿瘤占PCL的10%～15%[5]，种类繁多，且具有良性、交界性和恶性的不同程度分化。2019新版胰腺肿瘤分类中良性上皮性肿瘤及前驱病变包括浆液性囊腺瘤(serous cystadenoma, SCN)、胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)、导管内乳头状黏液性肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)、导管内嗜酸细胞性乳头状肿瘤(intraductal oncocytic papillary neoplasm, IOPN)、导管内管状乳头状肿瘤(intraductal tubulopapillary neoplasm, ITPN)、黏液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm, MCN)等。

30%以上的PCL是没有症状、在体检中偶然发现的[6]，80%无症状患者经手术病理证实为良性[7]。PPC、SCN(占手术切除PCL的10%[8])和低级别PanIN为良性病变，无症状者不必行手术治疗；而其他良性上皮性肿瘤及前驱病变具有潜在恶性，与实性假乳头状肿瘤(solid pseudopapillary tumors， SPN)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine， NEN)和PDAC的处理原则一样，无论是否有症状均应行手术治疗。但是，胰腺切除术创伤大、并发症多(20%～30%)，手术死亡的风险高(2%～4%)[9-10]。因此，术前确定PCL的性质与级别对于选择合适的治疗方案和手术方式有重要的指导意义[11]。

随着超声内镜技术的成熟与推广应用，通过超声内镜引导下细针穿刺活检(endoscopic ultrasonography-guided fine needle aspiration, EUS-FNA)抽取至少2 ml囊液，对肿瘤标志物、胰酶、黏蛋白和细胞等成分进行检测，可为判断PCL的性质与级别提供依据[12]。有研究观察到手术和EUS两种方法收集的PCL囊液样本在成分或含量方面没有显著差异，为EUS-FNA囊液的应用提供了保障[13-14]。本文就PCL囊液分析的研究进展进行综述。

一、肿瘤标志物

囊液肿瘤标志物检测的关键是探索最佳临界(cut off)值， 建立统一诊断标准。上世纪90年代，研究者发现CEA、CA19-9、CA72-4、CA153、CA125等肿瘤标志物对鉴别PCL有一定价值。随着研究深入和样本量扩大，筛选出对鉴别PCL良恶性价值最大的肿瘤标志物为CEA，其次为CA72-4和CA19-9，其他肿瘤标志物的价值十分有限。

1．CEA：CEA是肿瘤细胞表面的糖蛋白，PCL囊液中CEA水平在鉴别黏液性囊性病变与非黏液性囊性病变方面具有意义[15]。Lewandrowski等[16]通过研究PCL囊液，发现CEA在所有良、恶性胰腺黏液性囊性肿瘤中均明显升高(>367 U/L)，但是在PPC和SCN中却很低(<23 U/L)，提示CEA对鉴别黏液性和非黏液性囊性病变有一定价值(P<0.0001)。Brugge等[17]对341例PCL患者行EUS-FNA术，通过测定这些患者胰腺囊液中CEA水平，得出CEA鉴别黏液性和非黏液性病变的最佳cut off值为192 ng/ml，其灵敏度和特异度分别为75.0%和83.6%，准确率为79%，明显高于EUS形态学检查和细胞学检查，其他检查联合起来的诊断准确率也不如CEA单独使用时高，差异有统计学意义(P<0.05)。当囊液中CEA取cut off值为467 ng/ml时，囊液的CEA水平对鉴别黏液性囊腺癌与SCN或PPC的特异度可提高至98%，灵敏度达87%[18]。Ozlem等[19]对96例PCL患者进行回顾性研究发现，黏液性病变的囊液CEA水平显著高于非黏液性病变(P<0.05)，当囊液中CEA的cut off值为207 ng/ml时，区别黏液性病变的灵敏度为72.7%，特异度为97.7%，准确率为89.5%。Waaij等[20]对包含450例PCL患者的12项研究进行荟萃分析，发现CEA>800 ng/ml强烈提示黏液性肿瘤，如黏液性囊腺瘤或黏液性囊腺癌，其灵敏度为48%，特异度为98%；CEA<5 ng/ml诊断SCN或PPC的灵敏度为50%，特异度为95%，不需要进行手术治疗，但是其中仍有6%的患者可能是黏液性囊腺瘤或黏液性囊腺癌，因此建议行腹部B超或CT对这些患者进行随访。由于不同研究的cut off值不同，诊断黏液性囊性病变的灵敏度和特异度也存在着差异，但这些研究均提示测定囊液CEA水平可以为胰腺囊肿术前明确诊断和分类提供重要信息，也有研究[21]表明CEA与PCL的亚型有关。但CEA无法区别IPMN与MCN及病变的良恶性，且当囊液不足或黏度过高时囊液中CEA无法测定。

2．CA72-4：CA72-4是一种肿瘤相关糖蛋白，有研究表明CA72-4是预测PDAC淋巴结转移和预后的潜在标志物[22]。Hammel等[23]回顾性研究91例PCL患者囊液，结果提示，PPC和SCN囊液中CA72-4水平很低，当囊液中CA72-4 cut off 值为40 U/ml时，将黏液性囊肿与SCA或PPC区分开的灵敏度和特异度分别为63%和98%。Ozlem等[19]研究发现，当囊液中CA72-4 cut off值为3.32 ng/ml时，鉴别黏液性与非黏液性病变的灵敏度、特异度和准确率分别为80.0%、69.5%和73.6%。Brugge等[17]指出在鉴别黏液性囊肿和非黏液性囊肿方面，当CA72-4的cut off 值为7 U/ml时，灵敏度为80%，特异度为61%，准确率为72%。有报道测定19例PCL囊液的CA72-4水平，发现其在良恶性病变之间没有重叠，CA72-4>150 U/ml时诊断黏液性囊腺癌的灵敏度和特异度均可达100%，提示CA72-4可能是一个比较理想的肿瘤标志物[24]。

3．CA19-9：CA19-9是一种肿瘤相关糖蛋白，广泛用于胰腺癌诊断，可以更好地预测肿瘤恶性程度。但是囊液CA19-9水平在不同类型的PCL中没有明显差别，对于PCL分类的意义有限[25]。有研究[26]显示CA19-9>50 000 U/ml时诊断黏液性病变的特异度达到81%，而灵敏度仅为15%，但囊液中CA19-9水平正常可排除黏液性病变[27]。

二、生物化学指标

囊液中有潜在可能成为PCL分类或级别预测因素的生物化学指标较多，且生物化学检测在医院容易实现。当前临床常用的囊液生物化学检测是胰酶，此外有其他指标被陆续发现与PCL有关。

1．淀粉酶： 淀粉酶用于鉴别PCL是否与胰管相通，如PPC常与胰管相通，所以其囊液中淀粉酶水平较高。绝大多数PPC的囊液淀粉酶水平显著升高， 但高水平的淀粉酶并不是其特有的[28]，还有一部分黏液性囊性肿瘤如果与胰腺导管相通，其囊液的淀粉酶水平也升高。由于SCN发生位置一般离胰管较远，其囊液中淀粉酶水平是低的。如果选择健康者血清淀粉酶的上限(<250 U/ml)为囊液内淀粉酶浓度的cut off值，当囊液淀粉酶<250 U/ml时，对应可能病变是SCN、MCN或黏液性囊腺癌，灵敏度与特异度分别为44%和98%，如果囊液淀粉酶水平不高，可以排除PPC[20]。

2．葡萄糖：Park等[13]对45例PCL患者的囊液进行代谢组学分析，首次发现，与非黏液性囊肿相比，黏液性囊肿囊液中葡萄糖水平显著降低(0.278 mmol/L比4.552 mmol/L，P=0.002)。当囊液中葡萄糖cut off值为3.663 mmol/L时，鉴别黏液性囊肿与非黏液性囊肿的灵敏度、特异度和准确率分别为94%、64%和84%；鉴别SCA与非SCA病变的灵敏度、特异度和准确率分别为88%、89%和84%，其准确率类似于CEA>192 ng/ml时(77%)。而且，分析葡萄糖仅需要极少量的囊液(50 μl)，并可快速完成检测，相对于检测囊液中CEA(1 ml)具有优势，但还需要更多的多中心前瞻性研究证明其有效性。

3．黏蛋白：黏蛋白由黏液性囊性肿瘤细胞分泌，将囊液涂片进行黏液卡红染色，囊液中的黏蛋白可被染成红色。细胞外黏蛋白是黏液性肿瘤的独立预测因子[29]，对于囊液黏蛋白为中等量以上和(或)囊液 CEA水平>200 ng/ml的无症状患者，应建议行手术治疗。有研究[18]显示，黏液卡红染色诊断黏液性囊肿的灵敏度与特异度分别为55.5%(5/9)和100%，在 12个PPC和 6个SCN中未发现染色阳性。有研究[30]提示高级别PanIN、侵袭性IPMN囊液中黏蛋白2与黏蛋白4表达水平较低，但在中低级别PanIN的IPMN囊液中则明显升高，黏蛋白2与黏蛋白4有望成为鉴别IPMN良恶性的指标之一。 Cao等[31]通过抗体凝集素微阵列芯片技术在44例PCL患者中用72种凝集素捕获囊液中16种糖蛋白并对结果进行分析，提示黏蛋白5AC和糖化内啡肽蛋白在黏液性病变中表达较非黏液性病变中明显升高；联合检测诊断黏液性病变的准确率达93%(灵敏度89%，特异度100% )，优于CEA(准确率79%)。

4．网格蛋白(plectin)：plectin-1在肿瘤细胞中表达，可以通过外泌体进入囊液或血液，具有促进肿瘤生长和癌细胞侵袭的能力。 Kelly等[32]将噬菌体成像技术用于PDAC小鼠模型中，通过蛋白质组学分析，将plectin-1确定为PDAC的分子生物标志物。Shin等[33]的研究也表明PDAC细胞会产生含有plectin-1的外泌体。Bausch等[34]对7例IPMN囊液中plectin-1的表达情况进行免疫沉淀和蛋白质免疫印迹检测，结果显示4例恶性IPMN囊液中plectin-1表达均为阳性，而3例良性IPMN均表达阴性。一项多中心回顾性研究提示，囊液中plectin-1的定量测定可能是预测良恶性IPMN最灵敏、最可靠的检测方法[35]。

5．血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族：VEGF可以直接刺激血管内皮细胞增殖，当内皮细胞异常增生时，VEGF可以不受控制地大量分泌，参与肿瘤发展、侵袭和转移。Yip-Schneider等[36]分析87例PCL囊液中VEGF家族成员的表达情况， 结果提示VEGF-A>8 500 pg/ml时诊断 SCN的灵敏度与特异度分别为100%与97%。Alexandra等[37]检测149例PCL患者囊液中的VEGF-A水平，得出一致结论，同时该研究还发现囊液中VEGF-A 和CEA联合检测诊断SCN的灵敏度和特异度分别为95.5%和100%，达到了病理诊断的金标准。有研究[36]表明，当囊液中VEGF-A>8 500而<16 000 pg/ml时，联合囊液中CEA<5 ng/ml或 K-ras野生型或VHL突变或VEGF-C>200 pg/ml，诊断SCN准确率可提高到100%。

6．白介素(IL)：IL-1β由单核细胞分泌，诱导IRAK、MAPK和NF-κB等信号通路的激活，引起各种炎症因子转录，从而影响免疫反应[38]。Ajay等[39]对40例有不同程度异型增生或进展为侵袭性癌的IPMN患者囊液中的细胞因子进行检测，结果提示IL-1β表达水平随IPMN上皮内瘤变程度的升高而升高；当囊液中IL-1β的cut-off值取1.26 pg/ml时，鉴别IPMN良恶性的灵敏度和特异度分别为79.0%和95.2%。

7．前列腺素：前列腺素-2是人体中最丰富的前列腺素类，通过刺激细胞增殖、侵袭和血管生成来促进肿瘤的发展[40]。Schmidt等[41]对65例IPMN或MCN患者的囊液前列腺素-2水平进行分析，结果提示前列腺素-2在IPMN中表达水平明显高于MCN[(2.2±0.6)pg/μl比(0.2±0.1)pg/μl]，但在侵袭性IPMN，前列腺素-2水平下降。因此，囊液中的前列腺素-2水平有望成为IPMN恶性进展之前鉴别IPMN与 MCN的指标之一。

8．巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor, M-CSF)：M-CSF由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌，有募集免疫细胞的作用[42]。M-CSF也是急性胰腺炎相关性肺损伤的炎症介导因子[43]。Lee等[44]用炎症蛋白因子芯片分析来自10位PCL患者囊液中89种细胞因子的水平。结果显示，M-CSF出现在所有(5/10)炎性囊肿的囊液中且水平较高，没有出现在分支胰管型IPMN(5/10)患者囊液中(P<0.05)，说明M-CSF有望成为鉴别分支胰管型IPMN和胰腺炎性囊肿的生物标志物。

三、细胞学检查

囊液细胞学检查是通过检测已知的肿瘤细胞、含黏蛋白细胞、含糖原细胞和非特异性炎症细胞等，判断PCL病变类型。在多数研究中，细胞学检查特异度接近100%，但灵敏度通常不能令人满意，特别是囊液中细胞较少且不能排除来自胃或十二指肠黏膜上皮细胞和血细胞的存在。细胞学检查结果的判断与病理医师的经验有关，因此不同研究得出的灵敏度差异也较大。

术前囊液的获取方式多为EUS-FNA，抽吸的囊液可行生物化学指标及液基细胞学检测，囊壁活检组织条可行病理学检测，为PCL的诊断与治疗提供参考。但采样不充分可能导致结果假阴性或无法诊断，有报道指出23.0%～38.5% PCL的EUS-FNA细胞学评估无法进行[19,26]，限制了细胞学方法对PCL恶变程度的评估，但对于胰腺囊实性肿瘤或实性肿瘤，细胞学分析表现出较好的灵敏度与特异度[45]。Brugge等[17]的研究发现，细胞学诊断MCN或黏液性囊腺癌的灵敏度和特异度分别为35%和83%，其准确率(59%)与EUS形态学(51%)相近，但低于囊液CEA检测(79%)。在Ozlem等[19]的研究中，细胞学方法对鉴别黏液性病变和非黏液性病变的灵敏度和特异度分别为74%和100%，准确率为83.9%。因此，总体上说，细胞学检查的特异度较高，而且在诊断黏液性病变与分支胰管型IPMN方面有较大价值[46]。

细胞刷检是指穿刺针在超声内镜引导下反复穿过囊壁，过程至少持续30 s，以确保穿刺针充分切入囊壁，获取足够的囊壁上皮细胞，从而降低细胞学检查的假阴性。有研究报道[47]，细胞刷检对PCL诊断有一定帮助，但是反复穿过囊壁的安全性和操作规范仍有待进一步研究探讨。另外，也可以在EUS的配合下，通过SpyGlass系统获取囊液，但在PCL样本的获取中不及EUS-FNA应用广泛。

四、核酸分子分析

PCL的核酸分子诊断可直接通过由 Red Path国际病理研究所提供的 Path Finder TG报告获得，包括3条诊断标准：(1)DNA 浓 度≥40 ng/μl；(2)K-ras突变 ；(3)≥2处基因位点发生等位基因杂合性缺失。但是，有研究[48-49]对比分析Path Finder TG报告诊断结果与囊液CEA、细胞学或组织学诊断的一致性，结论尚未达成一致。美国癌症协会认为囊液核酸分子分析为PCL术前诊断提供了价值，尤其是恶性和良性黏液性胰腺囊肿的鉴别诊断[49]。

1．K-ras突变：K-ras是一种致癌基因，约95%PDAC存在K-ras突变[50]。但囊液中K-ras突变不是PCL的特异分子标志物，因为在慢性胰腺炎或其他炎性胰腺疾病中也发现类似表达[51]。Khalid等[52]报道囊液中K-ras突变诊断胰腺黏液性肿瘤的灵敏度与特异度分别为45%与96%；囊液中K-ras突变联合CEA>192 ng/ml诊断胰腺黏液性肿瘤的灵敏度与特异度分别为82%和83%，但无法鉴别IPMN与MCN。一项荟萃分析[53]也表明，检测囊液中K-ras突变不能排除黏液性或恶性胰腺囊肿可能。

2．GNAS突变：GNAS是编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G-protein)α亚基(Gs-α)的致癌基因，参与G蛋白耦联受体信号通路。Jian等[54]对19例IPMN患者的囊液进行大规模平行芯片检测169种已知与肿瘤发生发展有关的基因序列，并另外用65例IPMN患者囊液验证测序结果。研究显示，仅侵袭性IPMN囊液中发现 GNAS突变；在MCN与IOPN这类影像学表现难以与IPMN区分的PCL中，没有发现GNAS突变。在随后的研究中，结论与此一致[55]。

3．其他类型的基因突变：Khalid等[52]对113例PCL患者的囊液进行DNA分析，检测结果显示超过82%恶性PCL发生等位基因丢失(AUC=0.9)，且囊液中高DNA含量(光学密度比>10，AUC=0.79)，通过DNA分析可将所有细胞学结果为假阴性(10/40)的恶性囊肿诊断出来。但由于囊液DNA分析与囊液CEA水平、细胞学检查之间的准确率没有显著差异，所以不推荐常规使用，可在细胞学检查无法诊断或囊液不足以进行CEA检测时有选择使用[49]。

也有研究表明，检测囊液中SHH基因突变，可以将IPMN与慢性胰腺炎鉴别开，因为SHH突变在慢性胰腺炎囊液中检测不到，但在IPMN囊液中处于高水平[56-57]。

4．微小RNA(microRNA, miRNA)：miRNA是一类18～24个核苷酸组成的非编码RNA分子，其主要功能是调节核mRNA稳定地转录与翻译[58]。异常miRNA表达广泛存在于人类癌症中，胰腺癌发生发展的过程可以观察到早期就有异常的miRNA表达[59]。对miRNA表达谱的检测可在术前明确PCL的病变类型及性质，具有较好的临床应用前景。Ryu等[60]分析40例PCL患者囊液中5种对胰腺癌发生有重要作用的 miRNA(miR-21、miR-155、miR-221、miR-17-3p、miR-191)，发现黏液性囊性病变中miR-21、miR-221、miR17- 3P表达较非黏液性病变明显上调，尤其是miR-21过表达对诊断胰腺黏液性囊性病变的灵敏度与特异度最高，分别为76%和80%。miR-21是目前报道的唯一与侵袭性IPMN患者生存率相关的miRNA，其过表达的患者整体生存率及无病生存率较低，miR-21可作为预测患者死亡率和疾病进展的独立指标之一[61]。Farrell等[62]分析38例PCL的囊液中6种miRNA(miR-21、miR-155、miR-181c、miR-196a、miR-217、miR-221)的表达水平，结果显示，miR-21在良性病灶、癌变前病灶、恶性病变中的表达水平存在差异，可用于鉴别这3种病变类型； 而miR-221仅在恶性病变中呈明显的过表达，有助于恶性病变诊断。Matthaei等[63]利用TaqMan miRNA序列测定IPMN囊液中750种miRNA的表达水平，认为该模型区分高级别PanIN的IPMN与低级别PanIN的IPMN、SCN的灵敏度和特异度分别为89%和100%，可能会对IPMN的良恶性鉴别有所帮助。

当前，PCL的诊断通常为CT、MRI等影像学表现及EUS结果、囊液分析、细胞学分析等方法的联合。然而，在没有手术切除的情况下，PCL的诊断分类仍是不确定的。提供分子分析的其他检测可能会增加诊断的灵敏度和特异度，但仍有待探索合适的分子标志物和成熟的应用条件，不建议常规应用。随着对PCL生物学行为的不断了解，在液体活检基础上的PCL相关研究仍应继续。

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