分子标记技术的优缺点及在猪育种上的应用

张云鹏，高 一，张志彬，刘庆雨，张 琪，张树敏

（1.吉林农业大学，吉林 长春 130124；2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130124）

1 研究背景及意义

我国常见引进品种为大约克和长白猪的二元杂交品种，具有明显的繁殖优势，尤其丹系母猪品种产仔数可达到15～18头，而肥育猪多为杜长大三元杂交，具有良好的生长优势。我国本地品种的优良特性，例如松辽黑猪和新吉林黑猪，多为遗传性稳定、适应能力强、肉质风味独特等特点[1]，但在繁殖性能和生长速度方面相比国外引进品种有一定的差距。通过常规的培育方法改变国内品种比较缓慢。随着分子生物技术的发展，使用候选基因的标记辅助选择等技术与常规的育种技术相结合，选择出有较高繁殖性能的个体，对养猪业的经济效益有较大的意义。猪繁殖性能受许多主效基因的影响，如视黄醇结合蛋白4（RBP4）基因、催乳素受体（PRLR）基因等。标记辅助选择（Marker-Assisted Selection, MAS）是指利用遗传标记辅助选择控制某一性状的主效基因或数量性状位点（QTL），并进一步应用于该性状的选择。MAS方法的首要任务是精确定位控制数量性状的主效基因或QTL，其中最常用的QTL定位方法之一是候选基因法[2]。因此，从分子遗传学及生物学方面考虑，寻找与猪繁殖和生长性状相关的候选基因或遗传标记，可为今后本地品种繁殖和生长性能改良和寻找有效遗传标记位点提供参考依据。

2 分子标记技术

遗传标记是指可以用来区分生物个体或群体及其特定基因型的物质标记，并且可以是遗传稳定的。1970年以前，孟德尔创造了形态学遗传标记，后又经历了细胞遗传标记、免疫遗传标记和生化遗传标记几个阶段。自1970以来，随着分子遗传学的迅速兴起，限制性片段长度多态性、扩增片段长度多态性、单链构象多态性、单核苷酸多态性等分子标记技术不断发展，成为新一代遗传标记。分子遗传标记是以核苷酸序列变异为基础的遗传标记，在生物体中生长发育的不同阶段均存在。理想的分子标记相比于传统的遗传标记通常具有信息量大、分布广、稳定性强、重现性好、易检测等优势[2]。

2.1 限制性片段长度多态性（RFLP）

2.1.1 概念 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一种利用同源DNA序列变异的技术。用特定的限制性内切酶对DNA进行消化后，通过存在不同长度的片段来检测同源DNA分子的差异。在RFLP分析中，DNA样品用限制性内切酶切成片段，然后用琼脂糖凝胶电泳按片段长度进行分离[3]。

2.1.2 优缺点 与其他基因分型技术相比，RFLP具有一些优势。首先，RFLP位点分布在整个基因组中，标记具有较高的多态性。不同的限制性内切酶也可用于RFLP。其次，RFLP标记是共显性遗传，具有高度的重复性。第三，无论环境影响和基因互作，RFLP所鉴定的多态位点在不同品种中都能稳定地检测到。由于这些特性，该方法可以同时筛选大量样品。此外，DNA印迹可以用不同的RFLP探针进行重复分析。缺点是这项技术需要用限制性内切酶消化DNA，用琼脂糖凝胶电泳分离产生的片段，用毛细管将片段转移到膜上，以及用放射性标记的DNA探针进行southern印迹杂交。这些过程非常耗时，涉及昂贵的放射性/毒性试剂，并需要大量高质量的基因组DNA。近年来，这些缺点限制了RFLP的使用。近年来，人们将PCR技术与RFLP技术相结合，即PCR-RFLP，有效地弥补了传统RFLP技术的诸多不足，大幅简化了其操作程序[4]。

2.1.3 应用 RFLP是第一种DNA标记分析技术，于1975年首次用于识别腺病毒血清型的温度敏感突变的DNA序列多态性。广泛应用于基因组作图和变异分析，如基因指纹、构建遗传图谱、确定不同性状的候选基因位置、遗传疾病诊断和亲子鉴定[3]。Short和胡闪耀等[5-6]，利用RFLP-PCR检测方法分别对4 262头母猪和633头美系大白猪、963头法系大白猪进行研究，发现雌激素受体基因（ESR）位点多态性对母猪总产仔数及产活仔数等繁殖性状有显著影响。

2.2 简单序列重复（SSR）

2.2.1 概念 简单序列重复（simple sequence repeat, SSR）标记又称微卫星（microsatellite）DNA，微卫星，或简单序列重复（SSR），基于短（1～6 bp）DNA序列的串联重复序列，这些标记由于重复单位数的变化而高度多态。利用针对重复序列两侧保守区的特异引物，可以很容易地检测特定SSR基因座的重复长度[7]。

2.2.2 优缺点 SSR的高度变异性和共显性、在基因组中的分散性以及自动化的适用性是广泛应用的主要原因。SSR的主要局限性是在无法获得现有DNA序列时，分离和鉴定每个基因座所需的时间和成本较高。这一过程需要用SSR特异性探针构建和筛选大小选定的DNA片段的基因组文库，然后对分离的阳性克隆进行DNA测序，PCR引物合成和检测。只有这样才能确定SSR基因座的拷贝数、信息量和染色体位置。如果取消文库筛选，并从每个质粒克隆中获得一个以上SSR位点的序列信息，则可以大幅节省成本和时间[8]。

2.2.3 应用 SSR技术广泛用于DNA指纹、亲子鉴定、连锁图谱构建和群体遗传学研究的分子标记[7]。利用SSR技术探索微卫星DNA在猪个体识别和溯源应用中的可行性，对家畜屠宰后肉制品的跟踪、追溯具有重要价值。用于我国地方猪品种的遗传多样性，为快速、大规模评估我国地方猪种遗传资源提供了新的方法[9]。张彩红利用SSR技术对美系杜洛克猪、法系长白猪等5个品种的胰岛素样生长因子1（IGF-1）基因进行分型并关联分析，发现IGF-1基因位点多态性平均日增重和个体大小有显著相关[10]。

2.3 扩增片段长度多态性技术（AFLP）

2.3.1 概念 扩增片段长度多态性技术（AFLP）是1995年建立的一种高效的基因组指纹技术。AFLP是基于聚合酶链反应（PCR）的遗传多样性快速筛选标记。整个过程为每个个体生成独特的DNA指纹。个体间的遗传差异导致片段的大小和数量不同。每个DNA片段被称为一个位点或标记，并以其碱基对大小为特征[11]。

2.3.2 优缺点 AFLP方法可以从任何生物的DNA中快速产生数百个高度可复制的标记，因此，它们可以对指纹质量进行高分辨率的基因分型。由于AFLP每个个体产生大约100个DNA片段，仅根据长度从凝胶中分离单个感兴趣的DNA片段是不可行的。但AFLP的时间和成本效率、可复制性和分辨率均优于或等同于其他标记，例如随机扩增多态性DNA（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）、微卫星（SSR），只是AFLP方法主要产生显性标记而不是共显性标记。此外，该方法具有较高的鉴别能力和良好的重现性，能够在物种和品系水平上进行有效的鉴别。AFLP指纹没有必要事先了解微生物的基因组序列。此外，AFLP等位基因可以被荧光标记，允许在自动基因组分析仪中对多个样本进行平行表征[11-12]。

2.3.3 应用 AFLP技术已广泛应用于多种来源的DNA基因组指纹分析。AFLP是一种有价值的细菌分类技术，在物种和菌株水平上具有高分辨能力和良好的重现性。AFLP标记由于具有高度的可复制性和易用性，已成为一种重要的新型遗传标记，在系统学、病理分型、群体遗传学、DNA指纹图谱和QTL定位等方面有着广泛的应用[12]。另外可利用AFLP标记计算亲本群体间遗传关系，分析其遗传距离和猪的主要经济性状杂种优势的相关性，为猪杂交育种工作进展及地方猪种资源合理开发、筛选最优杂交组合提供了理论依据[13]。

2.4 单链构象多态性（SSCP）

2.4.1 概念 单链构象多态性（SSCP）是一种可重复、快速和非常简单的方法，用于检测聚合酶链反应扩增的DNA中的缺失/插入/重排。SSCP依赖的原理是非变性凝胶中单链DNA分子的电泳迁移率高度依赖于其大小和结构。在溶液中，由于单链核苷酸之间的碱基配对，单链DNA分子呈现二级和三级构象。这些构象取决于链的长度、序列以及碱基配对区域的位置和数量。因此，一级序列中特定核苷酸位置的突变可以改变分子的构象。当在非变性凝胶基质中分离时（温度为101 ℃），可以分辨出单个核苷酸不同的分子，因为不同的构象导致它们的迁移率发生变化。SSCP突变检测率根据参数而变化，例如片段的大小、序列的碱基组成、电泳温度和/或凝胶组成（即孔径和交联）[14]。

2.4.2 优缺点 SSCP方法在技术上相对简单，可以有效直观显示扩增产物（100～500 bp）内部和之间的不同序列类型，并每天快速筛选数百个样品。该技术实用、成本低且省时，还可以通过利用毛细管电泳而不是平板凝胶的电泳来适应高通量形式。但是基于凝胶的小规模SSCP方案中条带可以进行切除和测序，并且成本适中，这些比基于荧光的复杂毛细管SSCP系统更具优势。单链构象多态性（SSCP）指纹技术具有一些优点：聚合酶链反应（PCR）的引物只需要最小的5'端改变；SSCP适用于自动化测序仪中的高通量应用；SSCP凝胶电泳中的第二维度可用于获得高分辨率的2D凝胶。SSCP凝胶电泳的一个关键是严格的温度控制。在不同温度下运行的凝胶将产生完全不同的指纹。通过在不同温度下运行同一模板或通过2D-SSCP凝胶电泳，可以利用这一点改进对高度多样性群落的分析[15-16]。

2.4.3 应用 PCR-SSCP是一种新颖且广泛应用于基础和应用生物科学突变检测的方法。因此，PCR-SSCP被认为是一种最新的方法，不仅可以筛选潜在的序列变异，而且可以识别新的突变。此外，它的速度和简单的检测这些类似的突变，使其多应用在临床诊断实验室[17]。吴井生利用PCRSSCP和PCR-RFLP技术对枫泾猪、梅山猪和大白猪孕酮受体（PGR）基因进行多态性检测，发现PGR基因突变位点不同基因型总产仔数及产活仔数有显著差异[18]。林筱璐利用PCR-RFLP、PCRSSCP技术对雌激素相关受体α（ESRRα）、钙调神经磷酸酶相关肌小节蛋白-1（CS-1）基因多态性与猪肉质性状关联性的研究，ESRRα基因突变位点不同基因型长白猪的肌内脂肪含量均差异显著；而不同基因型杜洛克猪瘦肉率、背膘厚差异显著，CS-1基因突变位点不同基因型长白猪的瘦肉率、眼肌面积和眼肌厚度有显著差异[19]。

2.5 单核苷酸多态性（SNP）

2.5.1 概念 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是由个体基因组DNA序列之间相同位置的转换（C/T或G/A）或颠换（C/G，C/A，或T/A，T/G）引起的单核苷酸碱基变异。SNP是遗传变异的主要DNA多态性类型，它普遍存在于基因组的基因间隔区（基因间区）、基因的编码序列（外显子）或基因的非编码区（内含子、5'非编码区、3'非编码区或外显子-内含子剪接点）。编码区的SNP可分为同义SNP和非同义SNP两类，后者影响蛋白质序列。编码区和调控序列中的单核苷酸多态性分别对蛋白质功能和基因表达产生重要影响[20]。

2.5.2 优缺点 单核苷酸多态性具有高密度性、成本效益和高通量分析的优势，并易实现自动化，另外还有遗传稳定性好，检测速度快等优点[21]。随着大量SNP的发现，而高通量SNP基因分型的需求增加了，其中SNP基因分型技术包括基于凝胶的低通量方法、裂解扩增多态性序列（CAPS）标记方法、基于PCR的荧光标记高通量方法、高分辨率熔融曲线分析（HRM）、TaqMan探针法荧光定量PCR和竞争性等位基因特异性PCR（KASP）、固定阵列系统分析如Illumina Infinuium、Affymetrix Axiom以及新一代测序（NGS）方法，如限制性内切酶的测序基因分型（GBS）[22]。

2.5.3 应用 SNP在遗传学、育种学、生态学和进化研究中具有巨大的潜力。在作物遗传研究中主要用于关联作图和基因组选择。例如，在植物遗传学中，单核苷酸多态性已被广泛用于基于等位基因特异性分析鉴定物种内的顺式调控变异，以及发现与复杂遗传性状相关的基因。任丽群[23]利用DNA混池和DNA直接测序的方法对宗地花猪经产母猪进行研究，发现催乳素受体（PRLR）基因外显子10上5个SNP位点，不同基因型对宗地花猪的总产仔数、产活仔数等繁殖性状均有显著差异。

3 讨论

分子标记技术广泛用于基因指纹、连锁图谱构建、群体遗传学研究的分子标记、遗传疾病诊断和亲子鉴定。在遗传学、育种学、生态学和进化研究中具有巨大的潜力。在出现疫情时，往往带来的损失是不可必免的，也是惨痛的。而动物个体对疾病的抵抗力通常是治疗中的一个关键问题，如果通过分子标记技术选育出对疾病有较强抵抗力的个体，可以减少一定的损失。利用SNP基因分型寻找个体对疾病反应的遗传原因，将对疫情防控上产生深远的影响。另外，在动物育种方面，通过分子标记技术寻找与猪繁殖及生长相关基因的突变位点，分析其多态性与繁殖及生长性状关联性，有目的的对群体中具有优势个体进行选育，将对养殖行业带来很大的经济效益。基因分型技术正在不断的创新，这些进步以及数据挖掘和分析的强大工具带来的好处将在许多领域得到认可。