血小板功能的研究进展

梁学萍，范广来，范中原

（1.淮安市妇幼保健院，江苏 淮安 223002；2.南京医科大学康达学院，江苏 连云港 222000）

血小板功能检测是近几年逐渐在基层各家医院开展并广泛应用于临床的一项针对血小板的检测，之前只是注重对血小板计数、血小板体积、血块回收试验、网织血小板的检测。随着医疗发展，临床对血小板功能越来越重视，而不是仅仅停留在用血小板数量来判断血小板功能。目前国内外临床对血小板功能的检查主要有血小板黏附试验、血小板聚集试验、血小板释放，还有一些特殊检查：血小板代谢、血小板膜蛋白检测。血小板在血栓形成和止血中起着重要的调节作用，血小板功能的测试一直在出血疾病诊断和治疗中广泛应用，在心血管疾病、抗血小板药物监测、妊娠产科、围手术期评估出血风险。血小板在正常止血过程中起基础性作用，而其遗传或者后天功能障碍导致血小板功能异常，一些实验方法根据血小板聚集、血小板黏附、凝块形成过程中的黏弹性特征、血栓素代谢评价描述血小板功能不同方面。随着医疗发展，新的临床应用被不断地发现。血小板还有助于调节炎症、宿主预防和免疫、胎儿血管重塑、肿瘤生长和转移[1-2]。

1 血小板的相关介绍

血小板为圆盘型，体积比红细胞、白细胞小，大小2～4 μm。血小板计数正常值在(100～300)×109/L。血小板是由骨髓造血组织中的巨核细胞产生，平均寿命7～14 d。血小板是1882年由意大利医师Bizzozero发现的，他不仅在血液中识别出血小板而且利用实时显微镜观察到它们在血管壁受损区域形成血栓，现在该方法被用于详细地研究血小板与血管壁的相互作用和血栓形成的动力学[3]。血小板是一种复杂的细胞研究，需要专门的方法来捕捉这种血小板反应的多样性。为了应对这一挑战，人们研究了多种的血小板功能检测方法。

2 血小板功能检测的影响因素

2.1 血液采样条件 血液采样条件目前已经被证明影响血小板功能，包括昼夜规律[4]，运动[5]，禁食[6]，咖啡和含咖啡因的饮料[7-8]，和吸烟[9]。尽管在理想情况下，血小板功能研究样本只能收集到禁食和休息的，没有包括当天检测时吸烟、咖啡因摄入、运动以及已知会影响血小板功能的药物或物质（如抗炎药、抗血小板药物、磷酸二脂酶抑制剂，某些精神药物和草药），实际上很多这样的影响因素难以控制。

2.2 静脉穿刺 静脉穿刺应由经验丰富的抽血医生从肘前静脉窝采集血液，采用标准的、非创伤性的方案，使用最小的止血带压力进行干净的静脉穿刺[10]。采集管中血液与抗凝剂的比例，采集样本血液的不足和过度也会影响，应努力将血液抽取到制造商指定的标记，以避免造成抗凝比例失调。采集样本结束后应将采集管轻轻翻转3～5 次以使抗凝血剂与血液充分混合。

2.3 抗凝剂选择 在目前临床血小板功能检测中，最常用的抗凝剂是柠檬酸钠[10]，其他的抗凝剂还有肝素、双凝血酶/Xay因子抑制剂苄基磺酰-D-精氨酸-4-氨基苯甲酰胺和柠檬酸-葡萄酸[11]。有研究[12]表明，用柠檬酸钠能一定程度降低EDTA-K对血小板的影响。EDTA不是一种适合血小板功能检测的抗凝剂[13]。

2.4 其他 血小板功能受多种因素影响，如血小板计数、血细胞压积、白细胞。除此以外还包括年龄、体重、糖尿病、贫血等，种族、性别、饮食也会影响血小板功能检测[14]。

3 血小板功能实验室检测方法

3.1 出血时间（BT） BT最早是1910年由Duke开发，是第一个体内血小板试验。直到20世纪90年代仍然被认为是最有用的血小板功能试验[15]。BT是测量血小板和血浆黏附蛋白如血友病因子驱动的生理性止血，并整合血液成分与血管壁的相互作用。然而BT重复性差、有创性，对许多轻度血小板缺陷不敏感，且耗时。此外，BT的应用在过去20年里迅速减少，取而代之的是对新鲜采集的血液样本进行体外血小板功能测定。

3.2 光透射法（LTA） LTA于20世纪60年代初被引入，是血小板功能缺陷患者检测的金标准。这种光学检测是根据测得的浊度变化作为光透射的变化，而光透射的变化与加入激活剂诱导的血小板聚集程度成正比。在临床实践中使用光透射法来预测血栓形成的风险或监测抗血小板药物的疗效。LTA是通过标准化方法使用富血小板血浆的光透射来测量血小板聚集。当血小板在血小板激活剂作用下开始聚集时，悬浮液的浊度降低并转化为更高的透光率（乏血小板血浆的透光率用于定义100%的透光率）。因此，血小板聚集的动态是实时测量的血小板聚集。这种技术允许读出光的同时进行传输，从而测量在聚集过程中高密度颗粒的核酸分泌[16]。该方法对以血小板分泌异常为特征的常见疾病更敏感，对于临床怀疑血小板缺陷的患者，LTA是一种有用的首次筛选试验[15]。目前有几种常见的激活剂被用于光透射聚集仪中刺激血小板，比如二磷酸腺苷（ADP），花生四烯酸（AA），肾上腺素，胶原蛋白，血栓素类似物[17-18]。LTA需注意的是，实验中制备富血小板血浆的血液样本，需遵循标准化程序，以减少体外血小板活化和血小板脱敏的风险。还包括血液标本保存的温度、时间、血小板搅拌速度[18]。

3.3 全血阻抗法（WBA） WBA首次描述在1980年，是对全血中血小板的测量，因为它是敏感电阻抗的增加引起血小板功能聚集的形成，将两个电极浸泡在盐水稀释的全血中，在铂电极上的血小板受体激活剂稀释后损伤样本，电极浸入。该技术被用于监测血小板聚集抑制程度[19]。与光透射法相比，该方法对技术要求较低，耗时较长。WBA对许多变量比较敏感，包括血小板计数和红细胞压积[20]、抗凝剂使用、血液采样到检测的时间。

3.4 流式细胞术 流式细胞术是一种基于激光的技术，它根据单个细胞穿过光源产生的散射光提供了丰富信息。现在大多数机构都在使用，它可以在体外测试血小板反应性，检测活化的血小板，血小板-白细胞聚集物和循环中的血小板源性微粒[21]。流式细胞术检测血小板功能可用于监测抗血小板药物疗效，还可用于研究血小板分泌。传统的流式细胞术和双色流细胞术研究血小板聚集可能对研究儿童患者特别有用，因为他们只能抽取少量的血液样本，或者不能使用光透射法进行研究的中度、重度血小板减少症患者[22]。

3.5 血栓弹力图（TEG） 从血栓形成到溶栓，这种技术可以从整体上评估止血功能[23-24]。该检测方法是用全血在加热的杯子中孵育，在杯子中挂起一根连接电脑的针，随着血栓形成，针的运动被阻碍，这被解释为描述凝血强度的曲线。该方法对检测血小板功能的中度变化缺乏敏感性[25]。该试验执行速度相对较快（＜30 min），主要优点是提供血栓形成的完整过程，包括凝血动力学、凝血强度和纤维蛋白溶解度。该试验提供了全血凝块形成的全局成像以及血小板在内的全血元素与凝血系统之间的相互作用。血栓弹性成像测量全血凝块形成过程中发生的黏弹性变化，它受血小板功能、凝血因子、天然凝血抑制剂和纤维蛋白的影响。它被认为优于标准的凝血方法来治疗出血患者，特别是与获得性凝血障碍相关的患者[26]。也建议将其用于诊断血小板功能障碍或者监测抗血小板治疗[27]。

3.6 血小板功能分析仪 血小板功能分析仪PFA-100更新为PFA-200，是一种基于墨盒的分析方法。测量抗凝血样本堵住膜上150 μm孔所需的时间（模拟血管壁的损伤的部位）。全血通过毛细血管吸入，通过胶原蛋白和ADP或者肾上腺素覆盖的膜。该仪器测量剂量时间（CT），即血小板堵塞形成的停止血液的延迟时间。有两种墨盒可供测试，一种是孔径为150 μm上涂有胶原蛋白加ADP（c-ADP），另一种是在膜上胶原蛋白加肾上腺素（c-EPI）包裹。膜孔的闭合是由血小板堵塞形成引起的，这是系统高剪切作用和血液样本与膜的血栓形成表面相互作用的结果。这种检测方法简单、快速、只需要少量血液，而且不需要大量的专业培训，血小板计数和细胞压积影响闭合时间，血小板计数低于50×109/L或红细胞压积低于50%的患者仔细解释其结果。PFA-100对血小板功能轻度异常的敏感性较差，而血小板功能轻度异常是目前最常见的血小板功能障碍，因此不建议对疑似血小板功能障碍的患者进行筛选。

4 血小板功能的临床应用

4.1 血小板功能在止血和血栓中的应用 传统上，血小板功能检测的主要用途是识别异常出血潜在原因[28]，监测高风险出血患者的止血治疗，并在手术前或者手术中确保血小板功能正常[29]。血小板在止血中的主要作用：血管壁损伤时导致胶原和内皮蛋白暴露于血液，通过与血小板表面的GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物结合介导引发血小板初始黏附，然后血小板开始迅速并短暂的黏附或沿着血管壁流动。蛋白与GPⅥ结合导致细胞激活，从而通过受体GPⅡb/Ⅲa和α1β1形成牢固的黏附和扩散。血小板黏附也会导致细胞内信号传导和血小板活化，导致脱颗粒包括ADP的释放、血栓烷的产生、GPⅡb/Ⅲa复合物激活阴离子磷脂的暴露等。这些有助于血小板进一步聚集，介导纤维蛋白原和血管性血友病因子结合。血小板因子提供磷脂加速凝血酶和纤维蛋白原形成，从而稳定产生止血栓[3]。

目前，血小板功能在血栓中也应用广泛，比如心血管疾病、心机梗塞等，临床根据血小板这一项功能，许多抑制血小板聚集的药物已被批准用于血栓性疾病的治疗[30]。血小板功能在血栓中应用，当血小板被激活时，血小板上糖蛋白GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原或血管性血友病因子结合，从而介导血小板聚集。阻断GPⅡb/Ⅲa可以防止不依赖于激活血小板物质的血小板聚集，这种综合抑制血小板聚集的方法被认为是治疗各种临床血栓栓塞的有效方法。

4.2 诊断血小板功能障碍（PFD） 实验室检测血小板功能对于诊断先天性和获得性血小板疾病是重要的[31]。先天性血小板障碍分为：①黏附蛋白的血小板受体异常；②可溶性激活剂的血小板受体异常；③血小板颗粒异常；④信号传导的缺陷；⑤膜磷脂异常[32]。目前已经有几种不同的血小板功能检测用来识别和诊断血小板功能障碍，不同程度的血小板功能障碍采用不同的方法。在调查疑似先天性或获得性血小板功能障碍疾病时，有必要获得详细的临床表现和家族史，并在选择实验室测试之前进行体格检查[33-34]，特别是最近的用药史至关重要。应建议患者在可能的情况下停止使用任何可能干扰血小板的药物，有些药物可能会引起暂时性的止血缺陷，因此经常需要重复试验，血小板功能的其他获得性缺陷也可能与其他临床条件相关[35]。血小板功能检测对遗传性血小板障碍也有着重要作用。通常情况下，遗传性血小板功能障碍患者在手术或创伤后会出现不同程度的黏膜皮肤出血，其中血小板分泌和信号转导缺陷是最常见的。缺乏GPⅡb/Ⅲa的血小板分泌不仅具有聚集性缺陷，而且致密颗粒分泌受损，正常的聚集模式并不完全排除原发性分泌缺陷，这可能需要血小板分泌试验来检测[36-38]。血小板纤溶功能异常的血小板功能障碍特征是α颗粒中巨核细胞来源的尿激酶增强，当血小板合并到纤维蛋白凝块时诱导细胞内和细胞外蛋白水解[39]。

4.3 血小板功能在妊娠期的应用 血小板活化增加与产科并发症有关，如先兆子痫和宫内生长迟缓。血小板活化可以延伸到外周循环，外周循环激活血小板释放血管活性胺，可能是高血压和蛋白尿临床综合征的原因，这些临床综合征在妊娠合并先兆子痫和生长迟缓存在[40]，血小板聚集增加可能是胎盘介导的并发症的机制。抑制血小板聚集的药物可以预防血小板聚集[41]。血小板功能参数改变是子痫前期最常见的，对血小板功能检测可以预防子痫前期的风险[42]。妊娠与血小板凝血和纤溶等主要止血变化有关，因此妊娠可引起止血异常是由于滋养细胞浸入子宫内膜和胎儿胎盘的形成，早期孕期就可能出现凝血变化，这些变化易使妇女在怀孕期间和产褥期发生血栓栓塞和其他障碍，血小板功能的测定在血小板依赖性止血中发挥作用[43]。目前临床妊娠期血小板功能的检测主要用于止血、抗血栓药物的监测比如阿司匹林的监测，阿司匹林作为一种抗凝血剂的功能被用于探索先兆子痫的预防和治疗中。乙酰水杨酸可恢复胎儿有益的AA血清浓度，防止胎儿胎盘的血流量下降[44]。

4.4 评估对抗血小板药物疗效并指导临床用药 目前临床用于血小板治疗的药物主要有水杨酸类和噻吩吡啶类药物。水杨酸类的药物中阿司匹林临床应用最多，噻吩吡啶类药物在临床应用最为广泛的是氯吡格雷。通过不同的诱导剂诱导血小板聚集，然后监测血小板聚集率，根据血小板聚集率的情况反映血小板药物治疗的效果，目前应用最广泛的诱导剂是AA和ADP。阿司匹林的抗血小板作用是通过破坏环氧酶COX-1和COX-2的功能来实现的，它会导致环氧酶COX-1的530位和COX-2的516位丝氨酸不可逆的乙酰化，限制AA进入酶的催化活性位点从而阻止血栓烷的进一步合成。在生理条件下，血栓素在体内平衡，对血小板聚集和血管活动力有相反作用。氯吡格雷是一种有效的抗血栓药物，可抑制ADP诱导的血小板聚集，大量临床试验结果表明氯吡格雷在有症状性的动脉粥样硬化病史的患者预防血管缺血性事件（心肌梗死、中风）等方面优于阿司匹林。氯吡格雷的抗聚集作用归因于不可逆的抑制ADP与血小板表面嘌呤受体的结合[45]。随着抗血小板药物的研究发现，第三代噻吩吡啶—普拉格雷和替格瑞洛也被开发出来[46]。抗血小板药物治疗效果监测是一个阶段，通过服药前、服药中、服药后等不同的时期，对血小板聚集功能进行检查反映治疗的效果。抗血小板药物治疗的药效反应存在个体差异，在标准剂量的抗血小板药物治疗后，一些患者在进行血小板功能测试时出现高治疗的血小板反应（HPR）状态，未能达到足够的血小板抑制相反也会出现治疗中血小板反应较低而导致出血风险增高。所以在服药期间通过对血小板聚集功能测试可以对风险预测提供预测价值[47]。

5 总结

血小板有许多不同的功能，血小板与血液和血管壁的多种成分相互作用。一些新的血小板抑制剂被逐渐引入到临床实践中，越来越多的抑制剂被发现并使用。目前已经有许多种检测方法，针对不同的功能对血小板进行优化的特定测试。血小板功能试验主要用于血小板疾病的诊断检查，也用来评估抗血小板治疗效果，也适用于识别动脉血栓形成风险增加的患者。此外，血小板功能测试越来越多地被用于测量术前抗血小板治疗的残余效应，目的是降低出血风险。在有限的范围内，血小板功能检测试验也用于评估高聚集性，作为血小板治疗之外的血栓前状态的潜在标志物。

6 展望

随着医疗发展，血小板功能检测的应用越来越广泛，人们对将血小板功能测定用于其它目的越来越感兴趣。传统的血小板功能测定目前还没有标准化，对血小板功能检测结果的判定标准、治疗还不全面。为了优化血小板功能测试的使用，还需更多的研究，临床对血小板功能检测的质量保证也越来越重视。血小板功能检测除了限制在专门实验室，在患者床边检查血小板功能的护理仪器也被研究出来并大量在临床使用。因为传统的实验室检查时间较长，不能立即获得，因此血小板功能的点治疗也被研究进入临床使用。血小板功能的点治疗可以随时、立即提醒临床医生注意血小板过度活化的风险并测量抗血小板治疗的疗效。不断发展血小板功能检测新的方法和应用应被临床重视。