非编码RNA在百草枯中毒机制中的研究进展

孟婷婷综述 李铁刚审校

百草枯(paraquat,PQ)，又名对草快、克芜踪，化学名称为1，1-二甲基-4，4-联吡啶阳离子盐，是一种联吡啶类除草剂。由于其价格低廉，使用方便，已在世界范围内广泛使用，同时也成为发展中国家常见的农药中毒致死原因。据统计，百草枯中毒致死率高达50%～70%[1]。百草枯可通过消化道、呼吸道、皮肤吸收而致多器官损伤，但尤以肺损伤为主。一些学者认为百草枯与肺内二胺和腐胺、精胺、亚精胺等多胺的结构相似，从而导致肺竞争性地积累百草枯[2]。中毒者可出现致死性肺出血、水肿，经过抢救度过急性期的患者大多数也会发生不可逆性的肺纤维化、增生等改变；此外还可致肝、肾损害，同时累及循环、神经、血液、泌尿等系统[3]。由于没有特效解毒药，百草枯中毒预后很差。本文对近年来有关百草枯中毒的研究及长链非编码RNA在百草枯治疗中的进展进行综述。

1 非编码RNA定义

人类基因组研究计划成果认为，人类30多亿个碱基对的基因序列中2/3序列被反转录，而最终仅有不到2%核酸序列用于编码蛋白，大部分基因不表达蛋白质，这一类基因被称为非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。过去非编码RNA被认为是垃圾RNA，但随着研究深入，非编码RNA作为影响基因表达因素而逐渐被重视[4]。非编码RNA通常指不编码蛋白质的RNA，但这并不意味着这种RNA既不包含信息也不具有功能。随着高通量测序技术的突飞猛进，非编码RNA的研究也逐渐深入，这些RNA似乎包含一个隐藏的内部信号层。这些内部信号层控制着生理和发育中不同水平的基因表达，包括染色质结构、表观遗传记忆、转录、RNA剪接、编辑、翻译和翻转。人们意识到非编码RNA可以通过其稳定的二级或三级结构发挥多种生物学功能。非编码RNA 根据长度可划分为3类：<50 nt，包括microRNA、siRNA、piRNA；50～500 nt，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA 等；>500 nt，包括长的mRNA-like非编码RNA、长的不带polyA 尾巴的非编码RNA等。但目前的研究热点是具有调节功能的RNA，主要是miRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。许多非编码RNA多聚腺苷化后大部分仍会保留在核内，少数会被运输到胞质。胞内的miRNA和lncRNA分别与mRNA和miRNA的3’端非翻译区的碱基序列互补结合，进而影响RNA的降解或者翻译过程，导致靶细胞发生相应病理生理变化。

2 百草枯中毒机制

百草枯中毒机制尚未完全清楚，目前研究比较广的主要有以下几个学说：氧自由基产生学说、线粒体损伤学说、分子生物学说和酶失衡学说。这些学说都源于微粒体起源理论、线粒体起源理论[3]，即百草枯在含有肝微粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成系统的孵育混合物生物转化过程中形成了羟基自由基，而线粒体是百草枯自由基形成的场所和靶点。众多实验研究证实，百草枯所致的细胞损伤最初表现为线粒体肿胀，随后出现明显的细胞变性和细胞质水肿。自由基的强氧化性、氧化还原酶系的失衡损伤细胞的膜结构和功能、细胞内的能量、物质代谢系统障碍，最终导致细胞水肿、凋亡，加重组织炎性反应。而长链非编码RNA在百草枯中毒机制中通过其竞争性的结合mRNA，减弱miRNA对细胞调节作用，间接调控mRNA，而发挥着增强或减弱线粒体的损伤和胞内氧自由基的产生。

3 百草枯中毒肺损伤机制

百草枯中毒的动物实验和临床病例分析均已证明百草枯主要积聚在肺部，即使治疗后血液中的百草枯浓度降低，但肺内百草枯水平却无任何变化[3]。该效应可用肺内多胺转运系统解释，该转运系统在肺泡Ⅰ型、Ⅱ型细胞膜上大量表达。百草枯在肺内易聚集，不易消除的特点，使得肺成为百草枯对人体损害的首要靶器官。研究证实，上皮—间质转化机制、炎性因子的介导和氧化应激在百草枯致肺损伤中发挥重要作用。

3.1 上皮—间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT) EMT指上皮细胞从形态学上到间质细胞的转化，它赋予了细胞侵袭和迁移的能力。EMT被认为是肿瘤形成和器官纤维化形成中的重要步骤。Yamada等[5]证实EMT在百草枯致肺纤维化中也起着重要作用。肺纤维化中肌成纤维细胞主要由肺泡上皮细胞通过EMT而来，表现为上皮标志蛋白E-cadherin表达降低，而纤维化相关基因基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA水平升高[5-6]。除此之外，细胞因子在EMT形成过程中也扮演着重要角色。研究已经证实，转化生长因子β(TGF-β)激活TGF-β/Smad信号通路[7-8]；缺氧诱导因子-1α(HIF1α)调 控 Snail和 β-catenin信号通路[9-10]；HIF1α调节 LOX/β-catenin的表达[11]；结缔组织生长因子(CTGF)的表达均参与了EMT和早期肺纤维化的形成过程[12]。

3.2 炎性介质 参与和介导炎性反应的细胞因子称为炎性介质。目前研究已经发现，炎性介质可参与肿瘤形成、血液病发展、器官纤维化过程。百草枯可激活中性粒细胞、巨噬细胞等分泌细胞因子，参与肺纤维化过程。研究已经证实，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)、白介素1β(IL-1β)和IL-6的表达水平，在百草枯所致的急性肺损伤中明显升高[13]。

3.3 氧化应激 对百草枯中毒机制的研究发现，百草枯在被人体吸收进入血液循环后，经历了氧化还原循环的交替还原和再氧化过程，并在氧化还原循环过程中起到催化作用，生成负氧离子，然后引发一个级联反应，导致其他活性氧物种(ROS)的产生，主要是过氧化氢[14]。Adachid等[15]在2003年首次发现连续剂量的百草枯可致胆固醇过氧化和肺损伤。Chen等[16]研究显示,百草枯处理过小鼠的肺髓过氧化物酶活性、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和4-羟基壬醛(4-hydroxyneonal)蛋白活性升高，这进一步证实了氧化应激损伤在百草枯致肺纤维化进程中发挥重要作用。

4 非编码RNA与百草枯中毒机制

4.1 MicroRNA (miRNA) 与百草枯中毒 miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，能够与mRNA 的3’UTR(3’-untranslated region)互补结合，抑制mRNA的翻译或降低mRNA的稳定，从而调节mRNA的表达[17]，间接调控多种生物学行为，如增生、分化和凋亡。miRNA除可在肿瘤发生中发挥重要作用外，近来研究发现，miRNA在百草枯中毒中也扮演着重要角色。

黄敏等[18]用微阵列测序分析百草枯诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的miRNA测序谱显示，随着百草枯浓度的增加,miR-Let-7e表达水平持续下降,而miR-34a表达水平持续上升,bcl-2蛋白表达水平降低，且与miR-34a的表达量呈剂量—效应关系；这说明miRNAs的异常表达参与了PQ致PC12细胞损伤过程，同时PQ可能通过上调miR-34a表达增加bcl-2蛋白表达,进而诱导PC12细胞凋亡。朱勇[19]在百草枯致肺纤维化模型中发现HIF-1α及其靶基因micro RNA-210(miR-210)存在相互调控关系，并在致肺纤维化中对EMT有重要作用。PQ中毒后，大鼠肺组织即有HIF-1α表达显著升高；上皮标志物ZO-1和E-cadherin表达减少,间质标志物α-SMA明显增多,即发生了EMT；miR-210表达明显增加。在细胞内沉默HIF-1α后，Snail和β-catenin表达明显减少,PQ中毒诱导的EMT程度减轻；miR-210表达明显下降。而体外过表达miR-210后,间质标志物α-SMA进一步增多,上皮标志物ZO-1和E-cadherin进一步减少,EMT程度加重,HIF-1α表达增多；抑制miR-210后,明显减轻PQ中毒诱导的EMT,HIF-1α显著减少。以上的实验结果提示，HIF-1α和miR-210之间存在正反馈调控,细胞内HIF-1α增多,一方面调节EMT,另一方面进一步促进miR-210表达,形成恶性循环,不断促进PQ诱导的EMT和肺纤维化发生发展；HIF-1α可能是治疗PQ中毒致肺纤维化的一个潜在靶点。蔡志鹏[20]用百草枯诱导小鼠神经母细胞，探讨miR-380-3p在百草枯致神经细胞损害中的作用及其与Nrf2的关系。用qRT-PCR观察细胞mRNA表达水平，显示百草枯可下调神经细胞内miR-380-3p的表达水平，而转录因子Nrf2的激活可以上调神经细胞内miR-380-3p表达水平，miR-380-3p的过表达可导致神经细胞(Neuro-2a)增殖活性下降、凋亡率升高及周期阻滞。詹燕婷[21]通过实验观察miR-17-5p功能获得与功能失去在PQ致小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)增殖、凋亡、细胞周期改变中的影响，PQ可诱导神经细胞miR-17-5p表达下调和DNA甲基化水平升高；这说明miR-17-5p参与PQ诱导的神经细胞凋亡、细胞周期的改变。

因此，miRNA可以作为一种新的研究标志物，降低或抑制miRNA在体内的表达，从而引起百草枯诱导的细胞凋亡、细胞周期的改变，为百草枯中毒、治疗、预后提供一个新的思路。

4.2 lncRNA与百草枯中毒 lncRNA是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，过去人们认为lncRNA是转录“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能[22]。近年来随着对lncRNA的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程；同时也在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用[23-25]。在Salmena等[26]提出ceRNA概念后，科研人员发现lncRNA因miRNA含有某个或多个反应元件(microRNA response elements，MREs)，可与mRNAs竞争性结合miRNAs，从而调节mRNA的表达，参与肺纤维化、肿瘤、百草枯中毒等疾病的发生发展。近年来，有不少学者研究lncRNA作为调控生命活动的重要大分子在百草枯中毒中所扮演的重要角色，从而为百草枯中毒治疗、防治提供新的靶点。

杨虹雨等[27]研究了A07-17-0016 lncRNA NR_030777 在百草枯致神经细胞损害中对Zfp326/Cpne5 表达的调控及对细胞增殖凋亡的影响，PQ 处理可引起小鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a, N2a)增殖活力下降，细胞凋亡增加，NR_030777 LncRNANR_030777表达升高，Zfp326 mRNA 表达降低，Cpne5 mRNA表达升高；敲低NR_030777，会使PQ诱导的N2a细胞增殖活力、Zfp326 mRNA、Cpne5 mRNA表达量受到抑制；而过表达 NR_030777，会使PQ诱导的Zfp326 mRNA、Cpne5 mRNA表达量产生一定的协同作用；同时能够拮抗 PQ 对细胞的毒性。此研究说明，lncRNA能够调控mRNA分子的表达，并能够抵抗百草枯诱导的神经细胞损害作用。

张银银等[28]研究lncRNA-AK039862在PQ诱导的小鼠帕金森病模型中发现，lncRNA-AK039862在PQ抑制神经小胶质细胞和/或多巴胺能细胞增殖活力中起到协同作用；可在PQ处理的神经小胶质细胞中正向调控Foxa1基因转录过程,并促进Pafah1b1转录、翻译过程。陈俊杰[29]通过构建百草枯诱导的小鼠肺纤维化模型，抽取小鼠肺组织，行lncRNA芯片分析，发现多种lncRNA参与小鼠肺纤维化过程，选取其中差异表达的lncRNAuc.77及2700086A05Rik转染至人肺腺癌细胞(A549)，发现其靶基因ZEB2及HOXA3表达明显变化,并引起细胞形态改变,促进纤维化相关基因表达变化。以上的研究说明，lncRNA可以发挥其调节功能，从而影响细胞的生命活力。

5 小结与展望

非编码RNA虽然不能编码蛋白质，但能够与具有同源性的DNA和RNA结合，从而调节信息表达；也可以通过折叠其二级结构，参与转录前和转录后调控。综上所述，非编码RNA在百草枯中毒机制的研究中，其主要通过信号通路、细胞因子、蛋白分子的参与，或竞争性地结合miRNA调控EMT进程，调控相关凋亡蛋白分子等发挥影响。非编码RNA 在百草枯中毒机制研究取得的进展，为百草枯中毒治疗提供了非常有价值的生物学标志物和治疗靶点。但目前，针对非编码RNA在百草枯中毒机制的研究尚处于起始阶段，很多问题尚未解决，如非编码RNA如何在转录前、转录后调控相关信号通路、相关蛋白分子，又有哪些非编码RNA分子介导了炎性反应—免疫反应调控。这些问题引导临床继续深入探究非编码RNA在百草枯中毒中所起的作用。