阴道微生态与HPV感染及宫颈病变相关性的研究进展>

季璇，蔡云朗>

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009)

研究[1]表明宫颈癌是全球女性第2大恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，2018年我国新增宫颈癌患者约96 000例，占全世界新发宫颈癌的18%，其中死亡病例大约为26 000例。从癌前病变最后发展到宫颈癌是一个连续漫长的过程，持续的高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是其发生、发展的生物学病因，宫颈癌患者的HPV感染率高达99.7%[2]，然而，宫颈上皮细胞的病变并不是由HPV单独感染直接引起的，还需要其他因素的协同和促进。1889年英国医师Stephen Paget提出著名的“种子- 土壤学说”[3]，认为肿瘤的转移由肿瘤细胞的主动攻击及“土壤”(靶器官)共同决定。病毒感染也同样如此，HPV是否定植并且破坏宫颈黏膜，从而一步步演变为宫颈癌，不只是由病毒的毒力所决定，阴道微生态(“土壤”)的平衡状态也至关重要。因此，探讨阴道微生态与HPV感染及宫颈病变的相关性和发展机制，寻找新的临床预警指标，可以为HPV感染和癌前病变的防治提供新的思路，从而有效降低宫颈癌的发病率。作者拟针对阴道微生态与HPV感染及宫颈病变的相关性研究进展作一综述。

1 HPV特性及其分型

1.1 HPV特性及致病机制

HPV是无包膜的双链DNA病毒，编码8种主要蛋白质，6种位于“早期识别区域”(E1、E2、E4、E5、E6和E7)，两种位于“晚期识别区域”(L1和L2)。E1和E2参与病毒DNA复制和早期转录的调节；E4有助于病毒从上皮表面逃逸；E5、E6和E7是病毒致癌基因，其表达诱导细胞永生化和转化。E6和E7是两种病毒癌蛋白，它们分别使两种细胞肿瘤抑制蛋白P53和PRb失活，导致细胞周期紊乱，使得细胞逃避机体的免疫监视，从而发展为癌细胞，演变成宫颈癌[4]。

1.2 HPV分型

目前已知的HPV型别有200多种，根据HPV型别与子宫颈癌发生的危险性高低分为低危型HPV和高危型HPV。其中高危型中的16、18型与宫颈癌的联系最为紧密，此外，在亚洲国家中58、52型引起的宫颈癌所占比例也不容忽视[5- 6]。

2 HPV感染与宫颈病变

早在1983年，有研究人员[7]就利用原位杂交的方法在4例宫颈癌患者的肿瘤细胞基因组中检测到了HPV- 11相关的DNA片段，首次提出HPV是导致宫颈癌元凶之一的假说，这一假说后来也被多位学者证实。WHO在1995年宣布HPV是导致宫颈癌的首要因素。HPV病毒感染的早期发现及其与宫颈癌病情进展的关系，也逐渐得到了高度重视。2000年Sellors等[8]研究表明，HPV的感染率随着宫颈病变级别的升高呈现逐渐上升的趋势。研究[9]表明，绝大多数(90%以上)感染的患者可依靠自身免疫力自行清除，少部分(5%～10%)患者因各种原因发展为持续感染，从而一步步演变成宫颈癌。

3 阴道微生物群与HPV感染及宫颈病变的关系

3.1 阴道微生物结构

健康女性生殖道内寄居着多种微生物，与宿主和周围环境相互制约与协调，维持着动态平衡关系[10]。Ravel等[11]使用基于Roche 454 FLX的细菌16S rRNA基因测序，对396个种族不同的育龄妇女的阴道样本进行了分析，总共确定了282个分类单元，并且通过分层分类学将每个女性的阴道微生物谱分为5种“社区状态类型”(CST)。CST Ⅰ以卷曲乳杆菌为主；CST Ⅱ以加氏乳杆菌为主；CST Ⅲ以惰性乳杆菌为主；CST Ⅳ通常不含乳杆菌属，而是富含加德纳菌属、普氏菌属、阿托波氏菌等厌氧菌，阴道pH通常>4.5，被认为与细菌性阴道炎相关[12]；CST Ⅴ以詹氏乳杆菌为主，由较多的厌氧菌组成。

3.2 阴道微生物群与HPV感染的关系

正常情况下，阴道微生物群中以产过氧化氢(H2O2)的乳酸杆菌为优势菌，一方面，乳酸杆菌可通过产生乳酸和H2O2来维持阴道的酸性环境；另一方面，乳酸杆菌可分泌H2O2、细菌素及其他抗生物因子，从而抑制或杀灭病原微生物，同时通过竞争排斥机制阻止致病微生物黏附于阴道上皮细胞，维持阴道微生态平衡[13]。若乳酸杆菌丰度下降，不再成为优势菌，其他菌群，如加德纳菌、普氏菌属、纤毛菌属等厌氧菌属数量增多并转为优势菌群，则阴道微生态失衡，导致病原微生物入侵。

早在1994年就有学者发现，HR- HPV感染与阴道微生物群的失调存有一定的联系，阴道乳酸杆菌减少、厌氧菌过度生长，会增加高危型HPV的表达[14]。近年来，有越来越多的国内外学者在这方面进行了更深层次的研究。Lee等[15]首次利用高通量测序方法对韩国双胞胎女性HPV感染对阴道微生物群组的影响进行了横断面的研究，观察到HPV阳性的女性阴道微生物群更具多样性，而乳酸杆菌属则明显减少。此外，他们确定了纤毛菌属为HPV感染的标志性微生物，且在9对单卵双生的双胞胎中，HPV阳性者惰性乳杆菌比例较未感染HPV的双胞胎姐妹有明显的下降(P=0.03)。Brotman等[16]对北美32名性活跃的绝经前妇女进行了历时16周的纵向研究，在共计930个阴道样本中观察到CST类型与HPV的感染及持续时间显著相关(P=0.008)，CST Ⅲ、Ⅳ的女性HPV阳性率更高，分别为71%和72%，以加氏乳杆菌为主导的CST Ⅱ可能与急性HPV感染的最快速清除有关，提出加氏乳杆菌是维持宫颈健康的潜在治疗物种。古萍[17]等对128名女性进行随机对照研究，发现HPV阳性者阴道乳酸杆菌计数及乳酸杆菌所占阴道细菌比例较HPV阴性者低,并且随着乳酸杆菌数量的增多HPV- DNA载量逐渐减少，且两组阴道惰性乳杆菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌数量比较差异均有统计学意义。康玲[18]等通过探讨高级别宫颈鳞状上皮内瘤变 (HSIL) 锥切手术前后阴道菌群构成的差异发现，HPV阳性患者术后HPV转阴后阴道菌群出现了向常见阴道优势菌属转变的趋势，由原来的惰性乳杆菌转变为以卷曲乳杆菌为优势菌。骆菲等[19]通过分析39例高危型HPV感染患者的阴道菌群发现,加德纳菌属在HPV感染组低级别鳞状上皮内病变 (LSIL) 型患者中为优势菌, 乳杆菌属为HPV阴性者优势菌。提出高危型HPV感染者阴道菌群多样性增加，乳酸杆菌丰度下降，加德纳菌属为LSIL与HPV阴性女性的差异菌, 乳杆菌属为HPV阴性女性阴道特征菌。总之，结合国内外多项研究，可得出HPV阳性者阴道内乳酸杆菌的数量明显下降，除乳杆菌属之外的其他微生物群种类及数量增多。

3.3 阴道微生物群与宫颈病变严重程度的关系

继研究发现阴道微生物群与HPV感染的关系后，研究者也陆续对不同程度的宫颈病变患者的阴道微生物群结构进行了研究。Mitra等[20]对英国的169名妇女进行了研究(20名正常对照，52例LSIL，92例HSIL和5例浸润性宫颈癌)，结果显示随着宫颈病变程度的加重，阴道微生物群的多样性增加，而乳酸杆菌的相对丰度降低，随着疾病严重程度的增加，CST Ⅳ的患病率也逐步增加，LSIL、HSIL和浸润性宫颈癌的CST Ⅳ患病率分别高出2、3、4倍。此外，与LSIL相比，HSIL患者的纤毛菌属、厌氧球菌和消化链球菌等明显增多，而詹氏乳杆菌减少。随后有研究人员[21]对墨西哥的32名妇女(20例正常对照、4例宫颈上皮内瘤变和8例宫颈癌)的阴道微生物群和阴道黏膜细胞因子进行了研究，发现随着病变严重程度的增加纤毛菌属和梭状杆菌的数量相对增多，且梭状杆菌数量的增加与IL- 4和TGF- 1βmRNA的表达水平增高有关，认为可能是梭状杆菌抑制阴道局部免疫应答，促进HPV免疫逃逸和宫颈病变的发展。然而这两项研究均为观察性研究，缺乏纵向研究数据，因此只能证明与疾病状态相关，而不能确定因果关系。尽管多项研究已表明某些阴道微生物群可能会增加暂时性和持续性HPV感染的机会，但仍需要更多的工作来研究宿主、微生物群、病毒感染与癌变之间的复杂关系，为稳定阴道微生物群结构的治疗策略挖掘潜力，使之能够有效抵御病原微生物的入侵，这将有更深远的临床意义。

3.4 阴道微生物群介导的HPV感染的潜在机制

目前尚缺乏明确的相关机制的研究，可能的机制有：(1) 阴道乳酸杆菌通过分解阴道黏膜上皮内的糖原产生乳酸，降低阴道pH值，阴道的酸性环境可抑制HPV的感染；(2) 乳酸杆菌可产生H2O2促使蛋白抑制剂与其结合，抑制HPV的复制；(3) 阴道乳酸杆菌可生产细菌素等抑制物，来预防细菌性阴道病相关细菌的定植，从而维护宫颈上皮屏障功能，有效抑制HPV进入基底角质形成细胞；(4) 当与BV相关的厌氧菌定植时，这些细菌会产生酶和代谢产物，这可能会破坏宫颈上皮屏障，从而促进HPV进入。同时，阴道微生物群还可以通过作用于几种细胞途径，从而影响宫颈局部免疫系统，导致HPV持续感染以及宫颈病变进展[17,22- 23]。

4 阴道局部免疫系统与HPV感染的关系

4.1 HPV感染后的免疫应答

研究[24]表明，大部分女性能够通过自身免疫系统的监测和防御来自行清除HPV，避免HPV的持续性感染。人体免疫系统通常分为固有免疫和适应性免疫两种类型:固有免疫在HPV感染早期发挥非特异性作用；适应性免疫应答为机体防御HPV的第2道防线，可特异性识别HPV，防止HPV的再感染。固有免疫与适应性免疫相互协调，共同作用，HPV的防御和有效清除与机体正常的免疫功能密不可分。因此，若阴道局部免疫屏障受到破坏，则会增加HPV的易感性和持续感染率。

4.2 阴道局部固有免疫与HPV感染及宫颈病变的相关性

当病原微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，固有免疫可通过Toll样受体识别病原微生物，从而激活树突状细胞(DCs)或巨噬细胞，并且可同时调节固有免疫和适应性免疫[25]。DCs是目前发现的抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞，而DCs中尤其以朗格汉斯细胞(LC)的抗原提呈能力最为突出。江大琼[26]等研究发现，随着宫颈病变程度加重LC数量逐渐增多，LC数量HPV16阳性组比阴性组少(P=0.011)，提示当感染HPV16后局部的LC数量将会减少，这将会限制启动免疫应答，加重HPV16感染甚至发生持续感染。巨噬细胞功能弱于DCs，可分为M1型和M2型，M1型巨噬细胞主要分泌IL- 1、IL- 6、IFN- γ、TNF- α等细胞因子杀伤宿主细胞。自然杀伤细胞也对抵抗HPV感染起着重要作用，可分为非多样性自然杀伤T细胞(iNKT)与多样性自然杀伤T细胞(nNKT)。CD1d作为非典型的MHC- Ⅰ类分子可以将抗原递呈给iNKT，促使其分泌多种细胞因子，包括IFN- γ、IL- 4、IL- 10等，以抵抗病毒感染。Hu等[27]研究表明，在HPV阳性宫颈组织中观察到iNKT显著增加，尤其是在CINⅡ- Ⅲ中，并且随着宫颈病变程度加重HPV阳性宫颈组织中的IFN- γ表达也增加，认为从HPV感染到发展为CIN的过程中，宫颈组织中iNKT的聚集表明其可能在抑制免疫中起重要作用，IFN- γ表达可能与HPV感染状态有关。

4.3 阴道局部适应性免疫与HPV感染及宫颈病变的相关性

T细胞介导的细胞免疫是抗HPV感染最重要的一种免疫应答方式。研究[28- 29]表明，在高危型HPV感染合并或不合并宫颈病变的患者中，CD4+/CD8+T细胞的值均表现为降低，可以自行缓解的CINⅠ患者CD4+T细胞的表达及CD4+/CD8+T细胞的值均显著高于进展的CINⅡ和CINⅢ的患者，CD4+/CD8+T淋巴细胞<1的宫颈癌患者HPV阳性率远高于比值≥1的患者。

在发现T淋巴细胞亚群的失调与HPV感染及宫颈病变关系的基础上，也有越来越多的国内外学者从宫颈局部的细胞因子表达水平的层面进行了研究，有研究对宫颈局部T细胞亚群和炎症因子改变对HPV感染的影响进行了分析，发现随着宫颈病变程度的加重，宫颈局部CD4+/CD8+T细胞及Th1/Th2细胞的值均逐渐降低；IFN- γ、IL- 2的含量与HPV感染呈负相关，乳酸杆菌的阴性率、IL- 4的含量与HPV感染呈正相关，且IFN- γ、IL- 2的减少及IL- 4的增多都是HPV感染的独立危险因素[30]。Li等[31]对117例持续高危型HPV感染女性(43例慢性宫颈炎、35例LSIL、39例HSIL)的宫颈细胞因子(包括IL- 2、IL- 4、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、TNF、IFN- γ)的表达水平进行了研究，并根据IL- 2和IL- 6的表达水平进行细胞因子评分，结果显示疾病严重程度与IL- 6水平呈正相关，与IL- 2水平呈负相关。高细胞因子评分的HPV阳性患者3年内发生HSIL的风险增加，风险比为3.12。其中通过对HSIL组的细胞因子评分和TCT检查结果的比较发现，细胞因子评分的诊断敏感性、特异性、Youden指数以及阳性和阴性预测值均优于TCT。王小花等[32]研究也发现，HPV阳性者Th17细胞、IL- 17、IL- 6、IL- 4和TGF- β的表达水平均明显高于HPV阴性者。Winkle等[33]利用人类3- D阴道或宫颈组织来探索IL- 36γ在宿主抵御人类女性生殖道病原体中的可能作用，将阴道或宫颈上皮细胞暴露于病毒或细菌，并测定IL- 36γ及其受体的诱导和调控，结果发现IL- 36γ可通过增加基因表达使自身及其受体自我扩增，并促进其他炎症信号通路来刺激免疫应答，防止病原微生物的入侵和定植。这也是首次证明女性阴道上皮细胞中存在IL- 36γ及其受体并在此被病原微生物诱导分化的报道，证明IL- 36γ是微生物入侵上皮细胞后免疫激活的驱动因素，在女性生殖道的宿主防御中发挥着关键作用。IL- 36γ是一种新的促炎因子，属于IL- 1细胞因子家族，吕全省等[34]研究发现，IL- 36γ可以与IL- 12协同刺激CD8+T淋巴细胞的作用，增强其细胞因子分泌功能。此外，IL- 36γ可以作为免疫佐剂以诱导增强病毒特异性的CD4+T和CD8+T细胞应答，并可促进TNF和INF- γ的产生。但目前关于IL- 36γ与HPV感染及宫颈病变程度的相关性的研究尚且不多，还需临床进一步验证。

5 总结与展望

HPV感染是有过性生活的女性常见的一种病毒感染，但有90%以上的健康女性可自行清除病毒，阴道微生态的平衡是机体抵御HPV感染和定植的关键环节，阴道微生态的改变主要包括阴道内微生物群的改变、阴道局部免疫屏障的破坏等，一方面微生态平衡被打破，可导致HPV趁机入侵上皮细胞，造成HPV感染；另一方面可促进HPV的持续感染和宫颈病变的发生。与此同时，HPV的感染也会导致阴道微生态紊乱，两者互为因果，相互影响。因此，维持阴道微生态的平衡有助于防止HPV感染及宫颈病变的发生，探讨阴道微生态与宫颈HPV感染及宫颈病变的相关性和发展机制，寻找新的临床预警指标，对指导临床治疗HPV感染及宫颈病变至关重要，从根本上预防宫颈癌的发生。