自体脂肪移植技术的研究进展

邵倩倩，吕大伦

（皖南医学院第一附属医院弋矶山医院烧伤整形外科，安徽 芜湖，241001）

各种原因引起的软组织缺损或发育不全一直是整形外科医生关注的主要问题之一。近年来，由于自体脂肪移植在软组织填充中的应用及其对局部组织再生作用的不断发展，使得该技术在整形外科领域得到广泛接受和使用。目前经常报道的美容应用包括乳房、臀部、面部和手部的软组织增强，足底脂肪垫的改善、各种创伤后和手术后轮廓畸形的矫正以及改善增生性瘢痕组织、放射后后遗症、脂肪营养不良、色素沉着、衰老皮肤变化和光化性损害方面的应用等[1]。然而，研究显示移植后脂肪组织吸收率在20%～80%之间，可见移植后脂肪组织低存活率的问题仍然是目前困扰该技术发展的难题[2]。脂肪组织颗粒大小、脂肪细胞物理损伤、脂肪细胞缺氧时间、脂肪组织中脂肪干细胞的数量和受体微环境等都是影响脂肪移植的可调节因素。大量文献表明通过优化脂肪组织获取技术、移植前准备程序和移植后护理以及脂肪组织工程等，有望增加移植脂肪的体积保留率，改善移植效果。本文就自体脂肪移植技术的研究进展进行综述。

1 脂肪移植的科学基础

早在20世纪50年代Peer[3]等人就进行了体内脂肪移植的实验研究，这是研究脂肪细胞移植后如何存活的最早科学方法之一。他的细胞存活理论被广泛接受，并在接下来的几十年里指导了脂肪移植研究的方向。此理论认为脂肪移植物中的脂肪细胞在收获和加工后必须保持其活性，脂肪细胞获取时损伤程度越小，移植后脂肪存活率就越高。Carpaneda和 Ribeiro[4]在他们的研究中进一步证明，自体脂肪移植后在血管化组织2mm内的脂肪细胞可以通过胞浆吞噬和早期血运重建机制存活下来。这提示临床医生以及相关研究者们在注射脂肪移植物时，应每次少量，还应该在多层次多通道注射，通过增加移植脂肪组织与周围受体组织的接触面积来提高其成活率。此外，Zhao[5]等人进行了动物实验研究，他们证明了脂肪细胞在移植后可以直接存活，且随着时间推移受体部位会有新生血管生成。这些报道进一步支持了细胞存活理论。然而，该理论本身并不能解释临床上观察到的所有脂肪移植现象。随着最近的研究开始表明，移植物替代理论的接受度越来越高，即激活脂肪干细胞（Adiposederived stem cells，ADSCs）来替代退化的脂肪细胞。来自日本的Yoshimura[6]等人是移植物替代理论的主要支持者之一。他们专注于脂肪移植中各种细胞的作用，通过建立动物模型，来研究不同类型细胞在不同缺血条件下的命运。结果证明在重度缺血条件下，随着时间推移，所有的细胞都会退化。在轻度和中度缺血时，脂肪细胞容易死亡，而脂肪干细胞/前体细胞在缺血条件下能够存活下来，并被激活以进行脂肪组织的修复和替换。在他们随后的研究中，同一作者小组展示了移植后组织动态重塑的强有力证据[6]。他们观察到，移植的脂肪可以分为三个不同的区域，从外围到中心，存活区域(边缘组织300μm以内)，再生区和坏死区。这些区域对应前面描述的轻度、中度和重度缺血情况。在存活区和再生区，脂肪前体细胞经历活化和分化为新的脂肪细胞。从本质上讲，移植物替代理论指出，几乎所有的脂肪细胞，除了周围300μm内的脂肪细胞，在移植后的头几天内都会发生坏死。活化的ADSCs促进血管生成，而死亡的脂肪细胞形成脂滴，并被巨噬细胞吞噬吸收。一些死亡的脂肪细胞被来自前体细胞的新脂肪细胞取代。脂肪移植物保留的最终体积由祖细胞成功替代脂肪细胞的百分比决定。移植物存活理论部分解释了游离自体脂肪移植后移植物存活的机制，这使得临床关注的焦点是在移植过程中维持脂肪细胞的活性。而移植物替代理论用现代组织学和免疫组织化学染色技术表明，缺血区内的部分脂肪细胞发生坏死和变性，但这些缺血区也存在ADSCs的激活，ADSCs的激活导致新的脂肪细胞生成，这就构成了最终的脂肪存活量。总之，这两种理论都可能在最终的脂肪移植存活中发挥作用，而且每种理论在不同的患者身上都可能发挥更关键的作用。作为研究者深入了解脂肪组织移植的潜在机制，将有助于制定更好的策略，以改善脂肪移植后的临床结果。

2 脂肪组织的获取方式

脂肪收获的技术和方法有很多种，但对于哪种方法或技术能提供更多有活力和功能性的脂肪细胞，仍然存在很大的争议。脂肪移植物基本可划分为脂肪组织块、颗粒脂肪(包括纳米脂肪)、基质血管组分等。不管是团块脂肪、颗粒脂肪(纳米脂肪)还是基质血管组分的移植，保持脂肪组织结构的完整性才是最重要的。在目前的临床实践中，脂肪收获的方法主要有切割法和吸脂法，其中吸脂法包括真空辅助吸脂术和注射器吸脂术。目前国际公认的自体脂肪移植技术是科尔曼技术，该技术是将10毫升注射器与直径为3毫米的钝性针头连接以获得脂肪移植物的方法。与其他方法相比此方法对脂肪组织的损伤更小，在移植后脂肪存活率相对更高。并且已有相关研究证明，通过这种技术可以获得更多完整的和高酶活性(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的脂肪细胞，从而确保了移植脂肪细胞的存活[7]。Fan等人[8]使用直径为5mm的钝头套管和较大的侧孔(每孔直径约30mm)获得巨脂肪。随后，利用新发明的体外切割装置，将大脂肪切成微脂肪，命名为脂肪源性祖细胞富集脂肪(AER脂肪)，移植到裸鼠体内，结果显示AER脂肪含有更多的DPP4 +祖细胞并且具有更好的组织学结构和更高的毛细密度，移植后移植物的保留率明显高于科尔曼法组。

3 脂肪组织的基本处理技术

提高脂肪移植成活率的重要前是确保移植组织中脂肪细胞的活性，以及保持较高浓度的基质血管部分细胞和脂肪干细胞。在脂肪移植过程中应该优化脂肪组织收获后的处理方法以增加活性较高的基质血管部分细胞和脂肪干细胞的数量。目前，脂肪组织收获后的各种脂肪加工技术主要包括静置、离心、棉纱卷绕以及洗涤和过滤系统[9]。静置法是使用最早且最简单的脂肪移植物处理方法，其优点是不需要对移植物进行额外处理，不会造成脂肪组织的损耗，但是实际操作耗时较长，效率低，且对脂肪组织纯化不够彻底。部分学者认为，通过离心法获得的脂肪颗粒含有更少的杂质成分，但不同的离心速度会影响脂肪细胞的完整性[10]。多份报告显示，超过3000转/分(1200克)的离心力可能会导致更大程度的细胞损伤[11]。另外有研究表明，与离心、过滤和洗涤相比，棉纱布处理过的移植组织物保留了更多的完整细胞和高活性的脂肪组织[12]。简而言之，目前还没有一种技术能显示出比其他技术更好的脂肪移植效果。

4 脂肪组织移植前的辅助处理

脂肪移植后，移植组织内部需要尽早建立新的血供，避免因供血不足、缺氧、代谢产物堆积等造成的移植组织损害。如果受区供血不足，尤其是中央区移植组织不能及时得到血流灌注，将严重影响移植脂肪的成活率[13]。因此，对于改善脂肪细胞的成活率，加速移植后血供重建，改善移植组织血流灌注是十分必要的。为此，众多研究者纷纷进行了各种尝试，如移植前在移植脂肪组织中加入各种功能细胞、生长因子、干细胞以及药物等，来努力改善移植区的微环境，以期提高脂肪在受区的成活率。本文主要介绍几种常见的移植前辅助处理方法具体如下：

4.1 富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)和富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)

PRP中的生长因子可以促进移植脂肪组织中新生血管的形成，从而改善脂肪移植相关的缺血恢复[14]。有关研究也证明了PRP可以在体外提高脂肪细胞的存活率，促进脂肪干细胞增殖和分化[15]。此外，Yu[16]等人通过裸鼠实验模型证明了PRF可促进移植脂肪的自分泌功能，使其产生更多的生长因子。他们认为PRF可能通过促进血管重建和干细胞成脂化发生以及抑制细胞凋亡和调节胶原蛋白的产生，来提高了移植脂肪的保留率。他们还认为PRF在提高脂肪移植物存活率方面可能比PRP更好。而Grant[17]等人不同意这个观点，他们认为这是由于PRF在更长的时间内(14-20天)释放促血管生成生长因子的原因。并且认为在移植后24小时窗口期之后长时间注射生长因子对不能存活的脂肪细胞没有任何作用。到目前为止，只有1项研究[18]直接比较PRF和PRP，研究结果表明二者无明显差异，当然这不排除有可能是由于该项研究不足以(n=20)识别微小的差异。然而，PRP释放的生长因子半衰期较短，且在注射脂肪组织中分布不均，因此PRP在脂肪移植中的应用策略需要进一步完善。Li等人[19]基于移植后1周毛细血管开始长入脂肪移植物，2周达到高峰的特性，推测移植物内部延迟两步注射PRP，理论上可能会有利于移植脂肪组织内的微血管生长。因此他们利用裸鼠模型证明了新的延迟两步注射PRP策略可以显著提高脂肪的长期存留率，并改善脂肪移植物内部的新生血管植入程度。另外，研究显示PRP中不同的血小板浓度会导致不同浓度的生长因子和不同的治疗效果，PRP中生长因子的持续释放以及适宜的浓度都对治疗效果有着重要影响[20]。因此，PRP的制备和治疗方法还需要进一步规范和完善。

4.2 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF是促血管生成因子家族中的重要一员，其中的可溶性分泌型蛋白能直接诱导血管内皮细胞增殖，促进组织血管再生，并增加血管通透性。研究表明VEGF基因转染的人脂肪干细胞可以提高自体脂肪移植的存活率。Zhang 等人[21]通过裸鼠模型评价VEGF转染的人脂肪干细胞条件培养液(VEGFADSCs-CM)在脂肪移植中的作用。结果表明，VEGFADSCs-CM组的存活率最高，脂肪细胞形态最好，VEGF分泌水平也最高。因此，他们认为VEGFADSCs-CM作为脂肪移植的有效辅助手段能有效提高脂肪移植的存活率。Yu等人[22]在脂肪移植模型中研究表明，编码血管内皮生长因子的修饰mRNA（VEGFmodified mRNA，modVEGF）工程设计的人类脂肪来源的干细胞（Human adipose-derived stem cells，hADSCs）可以改善脂肪细胞脂肪的存活率，尤其是在长期移植后阶段。移植后第15、30和90天收集的脂肪移植物的详细组织学分析表明，从modVEGF工程化的hADSC中释放VEGF蛋白可显著改善新血管生成、血管成熟和细胞增殖。与对照组相比，modVEGF工程化的hADSCs还可以显著减轻移植脂肪组织纤维化、凋亡和坏死的存在。

4.3 脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)和细胞辅助脂肪移植（Cell-assisted lipotransfer，CAL）技术

ADSCs具有许多生物特性，且具有分化为脂肪胞、肌细胞、骨细胞、软骨细胞和内皮细胞等多种细胞类型的能力，有助于脂肪移植物的保留[23]。有研究发现ADSCs可以通过促进移植物内部血管生长因子表达，进而促进移植物内部血管化生成，以此来提高脂肪移植物保留率[24]。同时有研究发现，ADSCs不仅能在低氧条件下存活，而且能够加快移植后缺血的恢复，减少因低氧应激而死亡的细胞数量，从而改善移植物体积保留[25]。除此之外，ADSCs还可以通过旁分泌作用分泌各种生长因子，在抗凋亡、抗炎、血管生成和免疫调节中起重要作用[26]。目前，除了添加ADSCs外，研究者们还尝试在移植物中加入其他辅助细胞，如间质血管成分细胞、脐带间充质干细胞、骨髓干细胞等，称为细胞辅助脂肪移植技术，以期改善脂肪移植物的保留率。CAL的优势只有在注射小脂肪体积时才显得显著[27]。Zhou[28]等人的研究表明，与传统的脂肪移植相比，细胞辅助脂肪移植的效果更令人满意，然而它更适用于面部移植，而不是乳房移植。总之，到目前为止还没有足够的证据表明细胞辅助脂肪移植在减少并发症方面优于传统的脂肪移植。

4.4 基质血管成分（Stromal vascular fraction，SVF)

SVF匀浆包含多种活性细胞，主要包括脂肪来源的干细胞(ADSCs)、内皮细胞、内皮祖细胞、周细胞、成纤维细胞和免疫细胞等[29]。Zhu等人[30]利用小鼠实验证实，SVF通过促血管生成机制（旁分泌功能和参与新血管的形成）以及SVF的抗炎特性（各种细胞因子的表达和抑制以及巨噬细胞表型的转化）提高了脂肪移植后移植物的保留率。Yin等人[31]通过临床试验证明了自体SVF辅助脂肪移植不仅可以改善移植物的存活率，在改善面部皮肤质量方面的也有明显效果。研究表明SVF与VEGF、血管紧张素转换酶-1(Ang-1)等血管生成因子联合应用可促进血管生成。然而，由于血管生成因子的半衰期较短，直接使用这种混合物进行移植是不够的。He等人[32]通过实验评价了VEGF/Ang-1-PLGA(聚(乳酸-乙醇酸)共聚物)微球加SVF双缓释系统能否改善自体脂肪移植后的血管生成和移植物存活。结果表明，SVF联合VEGF/Ang-1-PLGA缓释微球可以改善自体脂肪移植后的血管生成和移植物存活。

4.5 A型肉毒毒素（Botulinum toxin A，BTX-A）

研究发现在脂肪移植中A型肉毒毒素可通过促进细胞增殖、脂肪生成和血管生成来改善脂肪组织的植入效果[33]。Nian[34]等人在利用大鼠模型实验证明去神经支配改善移植脂肪在肌肉中的存留率，他们认为肌肉的固定可以提高肌肉内注射的脂肪的保留率，这可能是因为固定化可以防止剪切力对新生血管的损伤，提高新生血管密度和ADSCs的密度。基于BTX-A固定肌肉的这一特性，他们做了另一项实验，即将经过BTX-A处理的脂肪移植物移植到大鼠身上，发现移植物保留率增加，细胞完整性得到保护，血管扩张和内皮细胞增殖得到增强。然后，他们用BTX-A培养ADSCs，发现BTX-A可以提高ADSCs的增殖、成脂化和血管生成能力。因此证明了BTX-A可提高移植脂肪在肌肉中的存留率、血管密度和成熟脂肪细胞密度，改善移植脂肪的组织学特性[35]。

4.6 去铁胺（Deferoxamine，DFO)

DFO是一种螯合剂，临床常用于治疗铁中毒和血色素沉着症。它能增加缺氧诱导因子-1α基因在细胞中的表达，并通过隔离铁来稳定缺氧诱导因子-1α，这是降解缺氧诱导因子-1α所必需的辅因子。因此DFO可以作为模拟缺氧的药物来诱导缺氧促进血管生成[36]。有研究发现DFO可增加大鼠脂肪移植物的存活率，并且可能是自体脂肪移植中有效的添加成分，其可增加脂肪移植物的生存力并获得持久稳定的移植效果[37]。有学者通过实验证明用DFO预处理可以增强放射治疗后脂肪移植软组织重建的效果[38]。Kim等人[39]利用大鼠模型实验证明自体脂肪移植中受体部位用DFO预处理可通过诱导VEGF表达和新生血管来增加脂肪移植物的存活率。

4.7 其他药物以及处理技术

相关研究指出，在脂肪移植物中加入胰岛素及胰岛素样生长因子[40]、碱性成纤维细胞生长因子[41]、白细胞介素-8[42]、选择性β1受体阻断剂[43]、胸腺素β4[44]等药物以及经过促红细胞生成素[45]、米诺环素[46]、透明质酸酶[47]、三苯氧胺[48]预处理都能不同程度的改善脂肪移植后的存活率，但移植后总体效果欠佳。Zhou等人[49]研究发现中药川芎嗪可提高脂肪干细胞移植存活率。该机制可能是其通过诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ、CCAAT/增强子结合蛋白α、Alu等与脂肪形成相关的转录因子的表达，从而促进脂肪细胞的生长。此外，有研究发现移植前对受体部位进行缺血缺氧预处理等也可以提高脂肪移植存活率[25]，但此方法的临床应用效果以及弊端还有待观察研究。

5 脂肪组织工程

近几年，随着组织工程学及再生医学的发展，为解决脂肪移植过程中低存活率的难题带来了新的解决思路。脂肪组织工程的构建需要选择合适的种子细胞、支架材料，以及适宜的微环境。目前脂肪组织工程常用的种子细胞有脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞等[50]。脱细胞真皮基质(Acellular dermal matrix，ADM)是目前组织工程中常用的支架材料，已被广泛应用于腹壁和乳房再造，以及与自体移植皮肤结合用于创面修复等[51]。Lee[52]等人发现，从人脂肪组织中获得的脂肪干细胞与微粒化脱细胞真皮基质共培养，植入体内后观察发现有脂肪组织再生。Zhu 等[53]将体外预处理过的ADSCs与激光打孔的异种(猪)脱细胞真皮基质（Porcine acellular dermal matrix，PADM）复合，在体内构建真皮－脂肪复合组织，结果发现仅复合物周边区域可见少量的炎症细胞，脂肪组织及微孔内均可见新生血管长入，提示了经过体外预处理的PADM植入体内后可获得充分的血供。另外有研究将PADM-脂肪颗粒混合物注入裸鼠体内，结果发现添加PADM显著降低了脂肪液化、促进了脂肪组织再生并提高了再生组织中CD34的水平。并且该实验提示PADM可通过增加巨噬细胞浸润、细胞外基质再生和血管重建来减少脂肪液化，从而提高了脂肪存活率[54]。

6 脂肪组织移植后的处理

脂肪移植术后，一般不需要使用抗生素。YU等人[55]在兔模型中发现脂肪移植术后注射丹参能促进脂肪组织移植血管的新生，显著提高自体移植脂肪组织的存活率。Zheng等人[56]也研究发现丹参具有提高隆胸手术脂肪保留率的潜力。由于移植物直到3个月后脂肪生成完成后才稳定下来，因此长期随访对于全面评估脂肪移植手术后的结果是至关重要的[57]。

7 展 望

随着自体脂肪组织作为软组织填充材料在临床中的广泛应用，提高脂肪移植的成活率成了许多学者的研究目标。虽然目前在脂肪移植物收获、移植物准备和移植物注射过程等方面的技术都有了不同程度的提高和改善。但由于设备和操作技巧的限制，这些方案很难标准化。添加各种生长因子以及药物促进脂肪组织再生是一种有效的方法。然而，对药物从研发到应用的安全性进行充分评价通常需要很长的时间，成本也非常高。使用干细胞作为添加剂也是提高脂肪存活率的有效方法。然而，干细胞的临床应用仍然受到法律以及伦理的限制。近几年，随着组织工程学及再生医学的发展，也为脂肪移植成活率的改善带来了新的灵感，然而目前相关研究以及技术还不成熟，如何同时发挥二者的优势，成为目前众多学者共同探索的目标。添加商品化生物材料混合移植技术，目前还在实验阶段，需要临床验证和长期观察来评估其安全性和有效性。因此，综合本文研究内容来看，目前尚且没有单一有效的方法能够保证脂肪移植的成活率。相信随着研究者对自体脂肪移植相关技术的不断深入认识，必将制定更好的策略来改善脂肪移植后的体积保留率以及临床效果，从而使其优越性得到充分发挥以及在临床中得到更广泛应用。