植物小孢子培养技术研究进展

肖婉露，马培芳,2，张 伟,2，王继芸,2，张国娜,2，蒋钦群，李纪军,2

(1.平顶山市农业科学院 河南 平顶山 467001；2.河南省韭菜工程技术研究中心 河南 平顶山 467001)

农作物及果树产业发展都依赖于高产优质的品种，而常规的杂交育种法往往需要亲本杂交之后再通过6～8代的回交和定向筛选才能实现优良性状的遗传改良。利用孤雌生殖、孤雄生殖或者无配子生殖产生单倍体再经过染色体加倍恢复育性的单倍体育种技术则可以直接获得优良纯合个体，可以大大缩短育种进程[1]。然而，单倍体的自然发生率只有0.05%～0.1%[2]，所以通过人工干预获得单倍体是实际育种中常用的方法。自从Guha和Maheshwari[3]首次发现花粉粒可以脱离正常配子体途径转向孢子体发育途径并在体外诱导胚状体后产生单倍体植株后，小孢子培养技术逐渐发展起来。目前该技术已经在小麦、玉米、辣椒、白菜、茄子等作物中广泛应用，在果树中应用还比较少，仅在油橄榄[4]、柑橘[5]等少量物种中有相关报道。这一技术的推广很大程度上受到育种材料基因型和技术体系成熟度的限制。本文结合目前植物小孢子的研究现状，综述了影响小孢子培养的主要因素进行以及小孢子培养技术面临的问题和对未来的展望。

1 小孢子培养技术原理及应用

植物小孢子培养和花药培养都是常用的单倍体育种方法。小孢子培养是通过直接从花蕾或者花药中分离新鲜的小孢子，通过组织培养技术，采用适宜的培养基和培养条件进行培养，诱导产生胚状体从而获得单倍体植株，再通过技术手段使染色体加倍，获得纯合可育的双单倍体(DH)的过程。与花药培养相比，小孢子培养可以排除花药壁和绒毡层细胞的干扰，保证所获得的植株是小孢子发育所得。小孢子培养所得良后代性状不分离，且表现整齐一致，明显缩短了育种年限。作为遗传工程中的一个工具，小孢子培养技术还可用于与远缘杂交相结合创制育种新材料、进行抗病、抗逆种质的筛选、与诱变技术相结合创制突变体、用于遗传作图等方面[6～8]。

2 小孢子胚状体诱导的主要影响因素

2.1 供体植株的基因型

基因型是影响小孢子出胚率的最重要因素之一，这不仅体现在物种间，物种内也有所体现[9]。姚悦海对12个羽衣甘蓝品种进行小孢子培养时发现，其中有1个品种不能诱导出胚状体，其它11个品种的出胚数最小值和最大值则分别为0.94和11.84[10]。赵艳艳在对10个菜心品种进行小孢子培养优化时发现只有3个品种获得了胚状体[11]。Pawel Nowaczyk[12]还发现，胚状体诱导率差异较大的两种基因型的母本杂交后产生的F1代，诱导率处于二者之间，吴艺飞进行红菜薹小孢子培养技术研究时，也得出同样的结论[13]。这一发现，可以通过优化小孢子培养条件，尝试用小孢子产胚率高的品种与产胚率低的品种杂交来突破基因型对小孢子培养的限制。

2.2 小孢子发育时期

理论上讲，小孢子各个发育阶段都具有全能性。但是在实际离体培养的过程中，不同时期的小孢子诱导产生胚状体的能力是有很大差别的，这在不同的物种以及同一物种的不同基因型之间都有所体现。目前已报道可成功诱导胚状体的植物中大多是处在小孢子单核靠边期至双核早期时诱导效果最佳[14～15]。小孢子的发育时期又和花蕾的外部形态、花药的颜色等相关联。汤泳萍在对芦笋小孢子培养研究时，发现花蕾纵径在2.099～2.284 mm，花蕾横径1.749～1.891 mm，花药长度1.149～1.225 mm，是小孢子培养最佳发育时期，此时小孢子正处于单核靠边期[16]。陈琛做了胡麻花蕾大小与小孢子发育时期的相关性研究，发现胡麻花蕾的不同长度也对应小孢子发育的不同时期[17]。据此，可以根据花蕾或者花药的形态来挑选最佳发育时期的小孢子进行培养。

2.3 预处理

预处理是诱导小孢子由配子体发育转向孢子体发育的重要因素之一。常用的方法包括热激处理、低温处理、盐处理等。预处理的目的在于人为地改变小孢子的内在状态，从而诱导小孢子转入孢子体发育[18]。4℃低温预处理24～48 h及33～34℃高温热激24～48 h都能有效促进叶用芥菜诱导产生胚状体[19]。32℃预处理2 d能够提高水稻小孢子的愈伤产量和绿苗率，离体穗低温处理21 d促进大麦游离小孢子产生胚状体效果最佳，同时10 mg·L-1秋水仙碱预处理也能明显提高水稻小孢子的愈伤产量[20]。在大麦花萌发期和小孢子期分别用15 g·L-1和0.3 g·L-1的NaCl溶液进行预处理后，能够显著提高小孢子愈伤产量[21]。范适还发现仅低温预处理的茄子小孢子不能启动小孢子脱分化，但是在低温处理一定时间后再进行热激处理则能极大提高小孢子胚状体的诱导频率[22]。因此不同的植物要通过试验来选择其适宜的预处理方法来提高小孢子诱导频率。

2.4 诱导培养基组分和激素

目前用于小孢子诱导的培养基有NLN、B5、MS、N6等，其中MS培养基含有较高浓度的无机盐，B5的铵浓度较低，N6多用于禾谷类。对于不同的物种需要调节碳源、氮源、pH值等条件来找出最适宜的配方。有研究表明把NLN培养基的蔗糖浓度调节至13%，在多种十字花科植物小孢子培养中能达到最佳效果[23～24]。大部分的诱导培养基中还需要添加一定的激素作为诱导剂来促进小孢子发育为胚状体，激素的配比及浓度是提高胚状体诱导成功率主要因素之一，常用的激素有NAA、6-BA、ZT等。不同的物种适宜的基本培养基及激素不同。芜菁小孢子有最佳诱导效果的是基本培养基中添加0.05 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA对有最佳的诱导效果[23]。诱导菜心小孢子时，在蔗糖浓度100 g·L-1的NLN中添加0.1 mg·L-16-BA和NAA效果最佳[25]。在改良过的N6培养基中添加1.5～2.0 mg·L-1的2，4-D则能有效优化大麦小孢子高频再生体系[26]。此外，高素燕对32个不同基因型的辣椒进行小孢子诱导胚状体时，还发现同样的物种中不同的基因型适宜添加的激素浓度也是有所差异的[27]。不过也有研究显示，有些基因型不添加激素就可以成功诱导胚状体，添加激素反而会降低出胚率甚至不出胚，而且可能会胚畸形[28]。所以在实际的育种试验中要先筛选出适合该基因型的基本培养基，然后再参考植株再生所用的激素进行不同的配比试验，优化小孢子培养体系。

2.5 外源添加物

培养基中的外源添加物在胚诱导中不是决定性因素，但是会影响小孢子胚诱导频率。其中活性炭是常用的一种添加物。许多研究表明小孢子培养过程中添加会产生酚类等有害物质，会降低胚状体的发生频率。天然吸附剂活性炭常被用于吸附这类有害物质。王葆生的研究表明，添加活性炭有利于胡萝卜小孢子胚的诱导，最佳浓度为0.2 g·L-1[29]。有些植物中，由于不同品种在培养过程中释放有害物量不同，所以活性炭产生的效果有所差异[30]。也有研究表明活性炭在小孢子培养中是必须的，但是不同浓度的活性炭对总胚状体的产量影响没有显著差异[31]。此外，也有研究低浓度的AgNO3[32]以及一定浓度的氨基酸类添加物[33]也有利于小孢子胚状体诱导。

2.6 植株组织共培养

植物花药壁、子房等组织与小孢子共培养也是影响小孢子胚状体的诱导频率的因素之一，在许植物中都已经证实了这个结论。小麦诱导培养基中加入未成熟的小麦子房与小孢子共培养，可以显著提高胚状体的质量，增加胚状体诱导率和植株再生能力[34]。花药壁组织与小孢子共培养能显著提高茄子小孢子胚状体的诱导频率[22]。Lantos等[35]利用小麦或辣椒子房共培养方式诱导辣椒胚状体，发现小麦子房共培养能够产生胚状体，诱导效果甚至优于辣椒子房共培养。子房和花药壁组织促进小孢子胚诱导的机理，目前还无定论，有学者猜测可能是因为子房在小孢子诱导过程中会释放一些含有PAA或者类似物及某些氨基酸类营养物质[36]。

3 胚状体再生

胚状体分化成植株是小孢子培养中的重要环节之一。该阶段主要的影响因素是培养基组分。一般的做法是参考适宜于供试材料的分化培养基组分，通过对激素浓度、碳源成分、pH值等条件调节进行改良。梁超凡研究发现，常规MS培养基+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+活性炭1 mg·L-1+蔗糖浓度为3%+琼脂浓度为1.2%)能够简单有效地诱导不接球白菜小孢子胚状体发育成植株[37]，不定芽成苗MS培养基中添加5μmol·L-1MT和0.1 mg·L-1NAA与对照相比能显著性地促进甘蓝DH植株生根和快速健壮生长[38]。培养基中的添加物也会对成苗率有较大的影响。有研究表明添加亚甲蓝能将大白菜小孢子形成胚状体的成苗率提高1.40～1.67倍[39]。王玉书在做羽衣甘蓝小孢子培养时，发现子叶形胚植株再生频率显著高于其它类型的胚，心形胚、球形胚和畸形胚只有很小一部分能发育形成植株[40]，一些研究也表明胚龄的长短及转分化的时间也是影响胚状体成苗的一个主要原因[41]。此外，胚状体发育的其它外部条件，如温度、光照、通气条件等也会对小孢子胚状体再生植株产生一定的影响。

4 问题与展望

目前小孢子培养技术在十字花科、禾本科植物中应用较为成熟，在大白菜、甘蓝、菜心、小麦等植物中都建立了完整的培养体系。但是其他的作物以及木本植物中诱导成功的相关报道还比较少，魏凌鹤对柑橘进行花药和小孢子培养创制单倍体时，花药培养可以成功诱导胚状体，而小孢子培养始终没有成功[5]。一些植物小孢子可以成功诱导成胚胎发育，但是诱导出的胚状体发育能力较差，再生植株成功率低[42]。虽然目前也有一些研究从胚胎发生的细胞形态学、代谢水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎发生机制，但是小孢子孢子体发育的诱导机制、启动机制尚不明确。今后应着重以下几方面的工作：

(1)参考已经建立的技术体系，对其它植物进行诱导条件的优化和尝试，使小孢子培养技术更广泛的应用。

(2)基因型影响小孢子培养的最关键因素，但差异是由哪些基因控制,其细胞结构、生理生化指标及基因表达是否有差异,培养技术改良是否要依据基因型差异而改变等方面需要进一步研究。结合转基因组进一步揭示小孢子胚发生的分子机制。

(3)外界条件能够诱导小孢子向孢子途径发育，但是可诱导胚胎发生的外界条件在不同的物种甚至同一物种的不同基因型之间都有很大的差异。小孢子改变配子体向孢子体发育的的途径受到什么调控，转向孢子体发育后生理生化会有什么变化，二者之间是否存在什么联系，这些问题都需要进一步论证。