实时荧光定量PCR检测痰及血液中结核杆菌的临床应用研究

文 /易琼英，王甜恬

肺结核疾病的致病菌为结核杆菌。结核杆菌在传播过程中，受体细胞的免疫功能降低，同时，还会对患者多处器官造成损伤。据有关统计表明：国内肺结核的发病率相对较高，且逐年提升。所以，肺结核需要做好早期诊断，才能够有效控制传染，还可以对患者的预后效果产生良好的改善作用。由此可见，通过有效的诊断方法对结核病患者的病情进行准确判断，意义重大[1]。因此，作者抽取我院于2019年08月至2020年12月期间收治的结核病患者508例作为研究对象，分析实时荧光定量PCR检测法的检测效果，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院于2019年08月至2020年12月期间收治的结核病患者508例作为研究对象，其中269例女性患者，239例男性患者，年龄范围在23-64岁之间，平均年龄为（52.21±5.76）岁，病程范围在2个月到12年之间，平均病程为（8.46±3.46）年。通过CT以及X线检查，患者的双肺纹理增多，并且变粗，部分患者还会出现胸痛、胸闷等情况。

1.2 方法

一方面，于清晨，采集患者的痰标本，将患者的痰标本和健康人群的痰标本进行对比。首先需要使用双氧水漱口，防止检测受到影响。患者用力咳嗽，采集第二次痰液，使用无菌器皿装好送检，连续三天获取痰标本做检测，通过镜检，对结核杆菌的阳性率进行统计。余下的痰液用三倍量的4%浓度的NaOH混相混合，然后进行室温液化，持续20分钟，之后离心5分钟，获取上清液，然后震荡处理，再以15000r/min的速度进行离心，持续十分钟，进行至少两次的去离子水沉淀；另一方面：采集外周血。于清晨，抽取患者空腹状态下5ml静脉血，将血液标本和EDTA凝胶相混合，做抗凝处理，然后弃置血浆，红细胞被灭菌高纯水溶解之后，再次离心十分钟，除去上清液，在沉淀标本中加入50μL DNA提取液震荡，然后离心5s，然后进行沸水浴，持续10分钟，之后将其放入4℃的水中半小时，之后转入100℃的水浴中做离心处理，保存上清液备用，裂解物在-20℃的环境下密闭保存，然后使用紫外分光光度计对RNA的浓度以及纯度进行测定。

实时荧光定量PCR技术：结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒，严格按照试剂盒上的说明书操作。使用25μl反应指标作为检测样本的判定标准。β-actin反应标准为：72℃延伸三十秒，94℃变形三十秒，94℃预变性两分钟，63℃退火三十秒，共36个循环，然后以扩增条件为检验，72℃延伸三十秒，94℃变形30s，94℃预变性2分钟，64℃退火30s，共42个循环。

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PCR痰定量阳性率为46.26%（235/508），痰涂片阳性率为14.96%（76/508），PCR外周血定量阳性率为59.84%（304/508），外周血定量阳性率和痰定量阳性率要高于痰涂片阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

肺结核患者的病理诊断需要将观察到的典型结核结节作为诊断依据，对于已经渗出的病变类型，典型结核结节并不常见，所以，临床中准确诊断的难度较大，具有一定的局限性。随着PCR技术逐渐发展，检测效率大大提升。通过荧光定量PCR检测法，可以对靶基因序列有效鉴别，通过荧光标记寡核苷酸探针扩增，对特异性荧光进行探测，然后通过对荧光值的增加情况进行检测，进而提高临床确诊率[2]。

荧光定量PCR检测法的原理是通过利用结核分枝杆菌的特异性，以及其荧光反应，判定结核杆菌。通分析PCR反应液和耐热DNA聚合酶的变化情况，然后和4种核苷酸单体相结合，作出判断。通过体外扩增法检测时，对于结合分枝杆菌基因的判断率显著提升。但是，该方法还尚不成熟，除此之外，对标本中的结核杆菌含量进行动态监测，其不会被细胞表型的内在所影响，特异性以及灵敏度较高，结核杆菌的测定结果准确率以及实效性明显提升[3]。

本次研究结果表明：PCR痰定量阳性率为46.26%（235/508），痰涂片阳性率为14.96%（76/508），PCR外周血定量阳性率为59.84%（304/508），外周血定量阳性率和痰定量阳性率要高于痰涂片阳性率。

综上所述，通过荧光定量PCR技术检测痰液和外周血中的结核杆菌来诊断肺结核，其阳性率明显提升，临床诊断精准度较高，值得推广。