JNK 调控阻塞性睡眠呼吸暂停合并高血压模式研究

张 可，陈 静，周 燕

（1.桂林医学院附属医院呼吸与危重症医学科/呼吸疾病实验室，广西 桂林 541000；2.泰安市中心医院呼吸内科，山东 泰安 271000）

阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea，OSA）是一种发病率日益增高的睡眠呼吸疾病，其病理生理学特点为间歇性低氧，与高血压密切相关[1]。血管重构与高血压密切相关，而血管内皮细胞表型转化是血管重构的重要环节[2]，阻断其发生发展是治疗高血压的重要途径，越来越受到临床的关注[3]。研究表明[4]，氧化应激会激活JNK 信号通路，是体内高血压进展的重要病理生理途径，介导着血管重构的发生。本研究通过观察间歇性低氧能否调控JNK信号通路引起高血压，并探讨其可能作用机制，旨在为治疗OSA 合并高血压提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物购自广西医科大学-广西实验动物中心，雄性8 周龄SD 大鼠共36 只，体重160～200 g，随机均分为四组：常氧对照组、常氧干预组、间歇性低氧组、间歇性低氧干预组，各9 只。

1.2 实验仪器与试剂 低压氧舱；动脉血压测量仪；光学显微镜；基因扩增仪：TC020A-230V；稳压电泳仪：DYY-6D型；蛋白转膜系统：TE22型；数码凝胶成像分析系统：JS-780型；数字图像分析系统：IPP-5.0 形态学分析软件；Trizol RNA 提取及逆转录试剂盒；JNK 阻滞剂：SP600125[5]；JNK-1 山羊抗小鼠多克隆抗体；BCA 蛋白浓度测定试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 将造模组大鼠放置于低氧舱内，每日固定时间循环充入氮气和氧气8 h，具体方法为首先充入氮气30 s，在30 s 内将氧浓度下降至4%～6%，保持该氧浓度1 min 使大鼠处于缺氧状态，然后充入氧气10 s，使氧浓度恢复至21%，保持20 s，持续2 min。常氧对照组及常氧对照干预组大鼠将充入气体更改为空气，进行相同处理，该处理持续12 周；常氧干预组及间歇性低氧干预组大鼠每天以30 mg/kg 的SP600125 进行灌胃，对剩余两组大鼠行生理盐水灌胃。

1.3.2 血压测定 在实验过程中，每周固定时间进行对鼠尾平均动脉血压（MAP）进行测定，测量3 次血压后取3 次血压的平均值。

1.3.3 病理学检测 不同组别大鼠处死后分离腹主动脉，固定标本后进行染色，观察腹主动脉病理学改变，并测量各组腹主动脉中膜厚度（MT）、管腔直径（LD）、两者比值以及中膜胶原纤维面积百分比。

1.3.4 Western blot 法检测JNK-1 蛋白在大鼠腹主动脉组织中的表达 称取各组大鼠腹主动脉10 mg 左右，经研磨-裂解-震荡-离心后吸取上清液测定蛋白浓度，最后通过Western blot 检测腹主动脉中JNK-1 蛋白水平。

1.3.5 RT-PCR 法检测JNK-1mRNA 在大鼠腹主动脉组织中的表达 取各组大鼠腹主动脉组织称重，选取等重量组织在低温条件下研磨至粉末状，按说明依次进行RNA 提取-测定RNA 纯度及完整度-RNA 逆转录-RT-PCR 进行JNK-1mRNA 目的基因片段扩增-RT-PCR 产物电泳。目的片段的相对表达量=JNK-1mRNA 的灰度值/β-actin 的灰度值。

1.4 统计学处理 用SPSS 21.0 软件进行数据处理，计量资料以（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压变化情况 与同周龄常氧对照组大鼠比较，自造模2 周后，间歇性低氧组大鼠血压升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与同周龄间歇低氧组大鼠比较，间歇性低氧干预组大鼠血压下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；间歇性低氧干预组大鼠血压与同周龄常氧对照组大鼠比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠血压变化情况（，mmHg）

表1 各组大鼠血压变化情况（，mmHg）

注：与常氧对照组比较，*P＜0.05；与间歇性低氧组比较，△P＜0.05

2.2 各组大鼠腹主动脉病理结果比较 各组大鼠腹主动脉内膜MT、LD、MT/LD 及中膜胶原纤维面积百分比变化情况见表2。与间歇性低氧组比较，间歇性低氧干预组大鼠腹主动脉无明显内膜破坏，动脉中膜血管平滑肌细胞（VSMCs）数量下降（P＜0.05），腹主动脉未见中层弹性膜明显增加，层次排列较整齐，壁层厚度较统一，层次较分明，未见平滑肌纤维破裂；与同培养时间常氧干预组大鼠比较，间歇性低氧干预组大鼠腹主动脉中膜血管平滑肌细胞（VSMCs）层数无明显增加或减少（P＞0.05），见图1。

图1 各组大鼠腹主动脉病理结果比较

表2 各组大鼠腹主动脉内膜各指标变化情况（）

表2 各组大鼠腹主动脉内膜各指标变化情况（）

注：与常氧对照组比较，*P＜0.05；与间歇性低氧组比较，△P＜0.05

2.3 各组大鼠腹主动脉JNK-1mRNA RT-PCR 表达比较 四组均于138 bp 处出现JNK-1mRNA 表达条带，其中间歇性低氧组表达量高于常氧对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在两间歇性低氧组中，间歇性低氧干预组JNK-1mRNA 表达量低于间歇性低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与常氧干预组比较，间歇性低氧干预组JNK-1mRNA 表达量增加，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 各组大鼠腹主动脉JNK-1mRNA RT-PCR 表达比较

2.4 各组大鼠胰腹主动脉JNK-1 蛋白Westernblot结果比较 与常氧对照组比较，间歇性低氧组JNK-1 蛋白表达水平增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与常氧对照组比较，间歇性低氧干预组JNK-1 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与常氧干预组比较，间歇低氧干预组JNK-1 蛋白表达水平增加，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 各组大鼠胰腹主动脉JNK-1 蛋白WesternBlot 结果比较

3 讨论

OSA 是一种发病率日益增长的呼吸睡眠疾病，目前我国OSA 患者已达6600 万[6]。OSA 患者在睡眠时反复出现上气道完全或部分堵塞，进而出现间歇性低氧表现，是高血压的独立危险因素[7]。研究表明[8]，OSA 主要通过激活交感神经系统、激活RASS系统、增加氧化应激、损伤内皮及全身炎症反应等方式导致高血压的发生。另有研究表明[9，10]，高血压的主要病理特点为血管内皮功能障碍，血管收缩增加和血管重构，而VSMCs 表型转化与血管重构密切相关，其主要通过免疫及炎症反应进行调节。由此推测，OSA 可能通过某种信号通路对VSMCs 进行调控，进而影响血管重构及高血压的发生。

c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导通路中的重要家族成员[11]。JNK 蛋白激酶由由三种蛋白激酶基因编码[12]，其中JNK1-3 通过磷酸化激活后，不同JNK 异构体通过特定模式与特定的蛋白底物激活、结合及进行磷酸化[13]。JNK 分别由JNK 激酶1、2 激活，并从细胞质向细胞核转移，进而与细胞核内的ATF2 和c-Jun 尾端的63、73 位丝氨酸结合，引导相关基因与蛋白的表达，广泛参与体内的炎症及免疫反应[14]。

目前研究JNK 信号及OSA 相互关系的实验不多，已有资料显示在大脑海马区的损伤中二者关系密切。相关研究表明[15]，大鼠在间歇性缺氧环境下海马区的JNK 磷酸化水平上升，诱导细胞的凋亡，进而对机体的学习记忆功能产生影响。丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是氧化应激的主要标志物[16]。间歇性低氧使机体MDA 表达水平上升及SOD 表达水平下降，同时导致JNK 表达水平上升，证实间歇性低氧会引导氧化应激反应的出现，进而上调JNK 基因及相关蛋白表达，对大鼠神经系统造成损害并破坏记忆功能[17]。另外，随着间歇性低氧持续时间增加，大鼠体内炎症反应亦随之增强，体内组织的相关JNK 基因及蛋白表达水平随之上升，由此推断JNK信号通路参与了OSA 患者炎症反应，并与炎症反应的发展密切相关。

当前有关JNK 信号通路作用于血管重构的研究较少。已有研究表明，血管重构与VSMCs 的表型转化密切相关，VSMCs 作为动脉中膜的主要细胞成分，可以根据生理形态及功能的不同，分为收缩型和合成型[18]。当受到免疫炎症反应刺激后，VSMCs 发生转化，其表达形式发生转变，由收缩型转化为合成型，进而介导VSMCs 增殖和转移，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增加，最终导致血管重构，这也是高血压的重要病理特征之一[19，20]。因此，JNK 信号通路作为的炎症反应信号通路，其可能参与了腹主动脉中VSMCs 的表型转化，进而介导血管重构的产生。

本研究结果显示，与常氧对照组大鼠比较，间歇性低氧组大鼠MAP 升高，而间歇性低氧干预组大鼠MAP 较间歇性低氧组大鼠下降，且与常氧干预组MAP 水平比较无差异，说明JNK 信号通路调控OSA 高血压的变化。本研究发现，间歇性低氧组大鼠腹主动脉出现血管壁炎性细胞浸润、弹性纤维损害、平滑肌细胞丢失及内膜厚度增加等血管重构现象，而间歇性低氧干预组中腹主动脉血管重构现象不明显，说明JNK 信号通路参与OSA 合并高血压大鼠的腹主动脉血管重构过程。另外，Western blot及RT-PCR 结果显示，间歇性低氧组大鼠腹主动脉组织中JNK mRNA 及JNK 相关蛋白的表达水平较常氧对照组增高，但与间歇性低氧干预组大鼠对比，JNK mRNA 及JNK 相关蛋白的表达水平下降，这进一步提示JNK 信号通路参与了OSA 合并高血压大鼠的血管重构现象，结合间歇性低氧组大鼠的血管重构现象，进一步说明了JNK 信号通路通过调节JNK mRNA 及JNK 相关蛋白的表达水平，影响腹主动脉血管重构，进而调控OSA 合并高血压大鼠的血管重构情况。因此，抑制JNK 信号通路可以抑制腹主动脉血管重构，进而抑制高血压的发生发展。

综上所述，间歇性低氧会激活JNK 信号通路，上调JNK 信号通路的mRNA 及蛋白表达水平，引起高血压，并介导大鼠腹主动脉出现的血管重构。阻断JNK 信号通路能抑制OSA 所致的血压升高及血管重构现象，这可能成为治疗阻塞性睡眠呼吸暂停合并高血压的新思路。